oncotomskСибирский онкологический журналSiberian journal of oncology1814-48612312-3168Tomsk National Research Medical Сепtеr of the Russian Academy of Sciences10.21294/1814-4861-2021-20-5-75-83oncotomsk-1917Research ArticleЛАБОРАТОРНЫЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯLABORATORY AND EXPERIMENTAL STUDIESВЫЯВЛЕНИЕ СОМАТИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ BRAF МЕТОДОМ ПИРОСЕКВЕНИРОВАНИЯDETECTION OF SOMATIC MUTATIONS IN THE BRAF GENE BY PYROSEQUENCINGhttps://orcid.org/0000-0003-4918-4907ДрибноходоваО. П.DribnokhodovaO. P.

кандидат биологических наук, научный сотрудник научной группы разработки новых методов выявления генетических полиморфизмов, 

111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, 3а

PhD, Researcher of Scientific Group for Development of New Methods of Genetic Polymorphisms Detection, 

3a, Novogireevskaya Street, 111123, Moscow

dribnokhodova@cmd.suhttps://orcid.org/0000-0002-4477-8506ДунаеваЕ. А.DunaevaE. A.

научный сотрудник научной группы разработки новых методов выявления генетических полиморфизмов, 

111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, 3а

Researcher of Scientific Group for Development of New Methods of Genetic Polymorphisms Detections, 

3a, Novogireevskaya Street, 111123, Moscow

ЛешкинаГ. В.LeshkinaG. V.

биолог подразделения молекулярных методов диагностики, 

111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, 3а

Biologist of the Molecular Diagnostic Methods Department, 

3a, Novogireevskaya Street, 111123, Moscow

https://orcid.org/0000-0003-3741-2474ЯрыгинаЕ. А.YaryginaE. A.

младший научный сотрудник научной группы разработки новых методов выявления генетических полиморфизмов, 

111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, 3а

Junior Researcher of Scientific Group for Development of New Methods of Genetic Polymorphisms Detection, 

3a, Novogireevskaya Street, 111123, Moscow

https://orcid.org/0000-0002-6892-3595БухаринаА. Ю.BukharinaA. Yu.

лаборант-исследователь подразделения молекулярных методов диагностики, 

111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, 3а

Laboratory Researcher Assistant of the Molecular Diagnostic Methods Department,

3a, Novogireevskaya Street, 111123, Moscow

ВойцеховскаяЯ. А.VoiciehovskayaYa. A.

кандидат биологических наук, научный сотрудник научной группы генной инженерии и биотехнологии, 

111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, 3а

PhD, Researcher of the Scientific Group of Genetic Engineering and Biotechnology, 

3a, Novogireevskaya Street, 111123, Moscow

БорисоваЭ. В.BorisovaE. V.

врач клинико-диагностической лаборатории,

111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, 3а

 Physician of Clinical Diagnostic Laboratory, 

3a, Novogireevskaya Street, 111123, Moscow

https://orcid.org/0000-0002-5950-9018БормотоваС. К.BormotovaS. K.

врач клинико-диагностической лаборатории, 

111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, 3а

Physician of Clinical Diagnostic Laboratory,

3a, Novogireevskaya Street, 111123, Moscow

ДаудА. И.DaoudA. I.

кандидат медицинских наук, заведующая клинико-диагностической лабораторией, 

220034, г. Минск ул. Платонова, 1Б

MD, PhD, Head of Clinical Diagnostic Laboratory,

1B, Platonov Street, 220034, Minsk

ХлявичВ. Н.KhlavichV. N.

врач УЗ-диагностики, онколог, 

220034, г. Минск ул. Платонова, 1Б

Ultrasound Diagnostic Physician, Oncologist, 

1B, Platonov Street, 220034, Minsk

https://orcid.org/0000-0001-8207-9215МироновК. О.MironovK. O.

доктор медицинских наук, руководитель научной группы разработки новых методов выявления генетических полиморфизмов, 

111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, 3а

PhD, DSc, Head of Scientific Group for Development of New Methods of Genetic Polymorphisms Detection, 

3a, Novogireevskaya Street, 111123, Moscow

ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» РоспотребнадзораРоссияCentral Research Institute of Epidemiology of The Federal Service on Customers’ Rights Protection and Human Well-being SurveillanceRussian FederationИностранное консультативное унитарное предприятие «МедАрт»БеларусьForeign unitary consultancy enterprise «MedArt»BelarusИностранное консультативное унитарное предприятие «МедАрт» 220034, г. Минск ул. Платонова, 1ББеларусьForeign unitary consultancy enterprise «MedArt»Belarus2021281020212057583Copyright © Дрибноходова О.П., Дунаева Е.А., Лешкина Г.В., Ярыгина Е.А., Бухарина А.Ю., Войцеховская Я.А., Борисова Э.В., Бормотова С.К., Дауд А.И., Хлявич В.Н., Миронов К.О., 20212021Дрибноходова О.П., Дунаева Е.А., Лешкина Г.В., Ярыгина Е.А., Бухарина А.Ю., Войцеховская Я.А., Борисова Э.В., Бормотова С.К., Дауд А.И., Хлявич В.Н., Миронов К.О.Dribnokhodova O.P., Dunaeva E.A., Leshkina G.V., Yarygina E.A., Bukharina A.Y., Voiciehovskaya Y.A., Borisova E.V., Bormotova S.K., Daoud A.I., Khlavich V.N., Mironov K.O.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.siboncoj.ru/jour/article/view/1917Введение

Введение. Определение соматических мутаций в гене BRAF может применяться в клинике для уточнения диагноза, выбора терапии и оценки прогноза заболевания. Технология пиросеквенирования позволяет выявлять как уже известные, так и новые мутации, а также определять долю мутантного аллеля в образце.

Цель исследования – разработка методики для выявления мутаций в 592–601 кодонах гена BRAF с помощью пиросеквенирования. материал и методы. Определяли нуклеотидную последовательность с использованием системы генетического анализа «PyroMark Q24». Аналитические характеристики методики определяли на разведениях образцов плазмидной ДНК, включающих участок гена BRAF без мутаций или с одной из мутаций V600E, V600R, V600K, V600M, K601Е. Апробацию провели на 200 образцах биологического материала из узловых образований щитовидной железы.

Результаты

Результаты. Разработанная методика позволяет определять образцы, содержащие 2 % мутантного аллеля для мутаций V600K и V600R, 3 % для V600E и V600M и 10 % для K601E. Значения сигнала для образцов без мутаций составили для разных мутаций от 0 до 19,5 %. Разработан алгоритм анализа для подтверждения наличия и дифференцировки мутаций в 600 кодоне на основе соотношения сигналов на пирограмме при низкой доле мутантного аллеля. При тестировании узловых образований щитовидной железы было обнаружено 47 образцов с мутациями, из них 45 с V600E и 1 с V600_K601>E, для одного образца не удалось установить тип мутации в 600 кодоне. Доля мутантного аллеля составляла 3,5–45 %. Концентрация выделенной ДНК менее 10 копий/мкл была получена в 47 образцах, из них в 8 образцах была обнаружена мутация.

Заключение

Заключение. Разработана методика для выявления соматических мутаций в 592–601 кодонах гена BRAF. Методика обеспечивает достаточную чувствительность для выявления частых мутаций в 600 кодоне и позволяет определять редкие мутации. Выделение ДНК из образцов, полученных при тонкоигольной аспирационной биопсии, в большинстве случаев обеспечивало достаточную концентрацию ДНК, что позволяет использовать методику в комплексе с цитологическим анализом без дополнительного забора материала. Использованный подход может быть применен для определения соматических мутаций во фрагментах ДНК сопоставимой длины для других онкогенов. 

Introduction

Introduction. Detection of somatic mutations in the BRAF gene can be used in clinical oncology to clarify the diagnosis, select therapy and assess the prognosis of the disease. Pyrosequencing technology makes it possible to identify both already known and new mutations, as well as to determine the mutant allele ratio in the sample.

The aim of the study was to develop the pyrosequencing-based method for detecting mutations in 592–601 codons of the BRAF gene.

Material and Methods

Material and Methods. The nucleotide sequences were obtained using «PyroMark Q24» instrument. The sensitivity and specificity of the method were estimated using dilutions of plasmid DNA samples containing the intact BRAF gene fragment mixed with sequence containing one of the mutations V600E, V600R, V600K, V600M, and K601E. The clinical testing was performed on 200 samples from thyroid nodules.

Results

Results. The developed method makes it possible to determine samples containing 2 % of the mutant allele for mutations V600K and V600R, 3 % for V600E and V600M, and 10 % for K601E. The pyrogram signal values for samples without mutations ranged from 0 to 19.5 % for different mutations. An analysis algorithm was developed to confirm the presence and differentiation of mutations in the 600 codon at a low proportion of the mutant allele based on the signals ratio on the pyrogram. The 47 clinical samples with mutations were found, 45 with V600E and 1 with V600_K601>E, for one sample, the type of mutation in the 600 codon could not be determined. The proportion of the mutant allele was 3.5–45 %. The concentration of extracted DNA less than 10 copies per mkl was obtained in 47 samples, of which 8 samples were found to have the mutations.

Conclusion

Conclusion. The pyrosequencing-based method was developed for the detection of somatic mutations in 592–601 codons of the BRAF gene. The technique provided sufficient sensitivity to detect frequent mutations in the 600 codon and allowed the detection of rare mutations. Extraction of DNA from clinical samples obtained by fine-needle aspiration biopsy in most cases provided a sufficient concentration of DNA, which made it possible to use the technique in combination with cytological analysis without additional sampling. This approach can be applied to determine somatic mutations in DNA fragments of same length for other oncogenes. 

пиросеквенированиеBRAFонкогенетикатонкоигольная аспирационная биопсиярак щитовидной железыpyrosequencingBRAFoncogeneticsfine-needle aspiration biopsythyroid cancerReferencesZaman A., Wu W., Bivona T.G. Targeting Oncogenic BRAF: Past, Present, and Future. Cancers (Basel). 2019; 11(8): 1197. doi: 10.3390/ cancers11081197.Zaman A., Wu W., Bivona T.G. Targeting Oncogenic BRAF: Past, Present, and Future. Cancers (Basel). 2019; 11(8): 1197. doi: 10.3390/ cancers11081197.Tate J.G., Bamford S., Jubb H.C., Sondka Z., Beare D.M., Bindal N., Boutselakis H., Cole C.G., Creatore C., Dawson E., Fish P., Harsha B., Hathaway C., Jupe S.C., Kok C.Y., Noble K., Ponting L., Ramshaw C.C., Rye C.E., Speedy H.E., Stefancsik R., Thompson S.L., Wang S., Ward S., Campbell P.J., Forbes S.A. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Res. 2019; 47(D1): D941–D947. doi: 10.1093/nar/gky1015.Tate J.G., Bamford S., Jubb H.C., Sondka Z., Beare D.M., Bindal N., Boutselakis H., Cole C.G., Creatore C., Dawson E., Fish P., Harsha B., Hathaway C., Jupe S.C., Kok C.Y., Noble K., Ponting L., Ramshaw C.C., Rye C.E., Speedy H.E., Stefancsik R., Thompson S.L., Wang S., Ward S., Campbell P.J., Forbes S.A. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Res. 2019; 47(D1): D941–D947. doi: 10.1093/nar/gky1015.Dumaz N., Jouenne F., Delyon J., Mourah S., Bensussan A., Lebbé C. Atypical BRAF and NRAS Mutations in Mucosal Melanoma. Cancers (Basel). 2019 Aug 8; 11(8): 1133. doi: 10.3390/cancers11081133.Dumaz N., Jouenne F., Delyon J., Mourah S., Bensussan A., Lebbé C. Atypical BRAF and NRAS Mutations in Mucosal Melanoma. Cancers (Basel). 2019 Aug 8; 11(8): 1133. doi: 10.3390/cancers11081133.Ducreux M., Chamseddine A., Laurent-Puig P., Smolenschi C., Hollebecque A., Dartigues P., Samallin E., Boige V., Malka D., Gelli M. Molecular targeted therapy of BRAF-mutant colorectal cancer. Ther Adv Med Oncol. 2019 Jun 18; 11: 1758835919856494. doi: 10.1177/1758835919856494.Ducreux M., Chamseddine A., Laurent-Puig P., Smolenschi C., Hollebecque A., Dartigues P., Samallin E., Boige V., Malka D., Gelli M. Molecular targeted therapy of BRAF-mutant colorectal cancer. Ther Adv Med Oncol. 2019 Jun 18; 11: 1758835919856494. doi: 10.1177/1758835919856494.Cibas E.S., Ali S.Z. The 2017 Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology. Thyroid. 2017 Nov; 27(11): 1341–1346. doi: 10.1089/thy.2017.0500.Cibas E.S., Ali S.Z. The 2017 Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology. Thyroid. 2017 Nov; 27(11): 1341–1346. doi: 10.1089/thy.2017.0500.Бельцевич Д.Г., Мудунов А.М., Ванушко В.Э., Румянцев П.О., Мельниченко Г.А., Кузнецов Н.С., Подвязников С.О., Алымов Ю.В., Поляков А.П., Фадеев В.В., Болотин М.В., Севрюков Ф.Е., Крылов В.В., Феденко А.А., Болотина Л.В., Жаров А.А., Фалалеева Н.А., Филоненко Е.В., Невольских А.А., Иванов С.А., Хайлова Ж.В., Геворкян Т.Г. Клинические рекомендации: Дифференцированный рак щитовидной железы. 2020. 47 c. [Интернет]. URL: http://cr.rosminzdrav.ru/#!/recomend/977 (дата обращения: 20.10.2020).Beltsevich D.G., Mudunov A.M., Vanushko V.E., Rumyantsev P.O., Melnichenko G.A., Kuznetsov N.S., Podvyaznikov S.O., Alymov Yu.V., Polyakov A.P., Fadeev V.V., Bolotin M.V., Sevryukov F.E., Krylov V.V., Fedenko A.A., Bolotina L.V., Zharov A.A., Falaleeva N.A., Filonenko E.V., Nevol’skikh A.A., Ivanov S.A., Khailova Zh.V., Gevorkyan T.G. Clinical Guidelines: Differentiated Thyroid Cancer. 2020. 47 p. [Internet]. URL: http://cr.rosminzdrav.ru/#!/recomend/977 (cited: 20.10.2020). (in Russian).Patel K.N., Yip L., Lubitz C.C., Grubbs E.G., Miller B.S., Shen W., Angelos P., Chen H., Doherty G.M., Fahey T.J.3rd, Kebebew E., Livolsi V.A., Perrier N.D., Sipos J.A., Sosa J.A., Steward D., Tufano R.P., McHenry C.R., Carty S.E. The American Association of Endocrine Surgeons Guidelines for the Definitive Surgical Management of Thyroid Disease in Adults. Ann Surg. 2020 Mar; 271(3): e21–e93. doi: 10.1097/ SLA.0000000000003580.Patel K.N., Yip L., Lubitz C.C., Grubbs E.G., Miller B.S., Shen W., Angelos P., Chen H., Doherty G.M., Fahey T.J.3rd, Kebebew E., Livolsi V.A., Perrier N.D., Sipos J.A., Sosa J.A., Steward D., Tufano R.P., McHenry C.R., Carty S.E. The American Association of Endocrine Surgeons Guidelines for the Definitive Surgical Management of Thyroid Disease in Adults. Ann Surg. 2020 Mar; 271(3): e21–e93. doi: 10.1097/ SLA.0000000000003580.Haugen B.R., Alexander E.K., Bible K.C., Doherty G.M., Mandel S.J., Nikiforov Y.E., Pacini F., Randolph G.W., Sawka A.M., Schlumberger M., Schuff K.G., Sherman S.I., Sosa J.A., Steward D.L., Tuttle R.M., Wartofsky L. 2015 American Thyroid Association Management Guidelines for Adult Patients with Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer: The American Thyroid Association Guidelines Task Force on Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer. Thyroid. 2016 Jan; 26(1): 1–133. doi: 10.1089/thy.2015.0020.Haugen B.R., Alexander E.K., Bible K.C., Doherty G.M., Mandel S.J., Nikiforov Y.E., Pacini F., Randolph G.W., Sawka A.M., Schlumberger M., Schuff K.G., Sherman S.I., Sosa J.A., Steward D.L., Tuttle R.M., Wartofsky L. 2015 American Thyroid Association Management Guidelines for Adult Patients with Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer: The American Thyroid Association Guidelines Task Force on Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer. Thyroid. 2016 Jan; 26(1): 1–133. doi: 10.1089/thy.2015.0020.Poller D.N., Glaysher S. Molecular pathology and thyroid FNA. Cytopathology. 2017 Dec; 28(6): 475–481. doi: 10.1111/cyt.12492.Poller D.N., Glaysher S. Molecular pathology and thyroid FNA. Cytopathology. 2017 Dec; 28(6): 475–481. doi: 10.1111/cyt.12492.Миронов К.О., Дунаева Е.А., Дрибноходова О.П., Шипулин Г.А. Опыт использования систем генетического анализа на основе технологии пиросеквенирования. Справочник заведующего КДЛ. 2016; 5: 33–42.Mironov K.O., Dunaeva E.A., Dribnokhodova O.P., Shipulin G.A. Using genetic analysis system based on pyrosequencing method. Spravochnik zaveduyushchego KDL. 2016; 5: 33–42. (in Russian).Дунаева Е.А., Миронов К.О., Дрибноходова О.П., Субботина Т.Е., Башмакова Е.Е., Ольховский И.А., Шипулин Г.А. Количественное определение мутации V617F в гене JAK2 методом пиросеквенирования. Клиническая лабораторная диагностика. 2014; 59(11): 60–63.Dunaeva E.A., Миронов К.О., Dribnokhodova O.P., Subbotina T.N., Bashmakova E.E., Olhovskii I.A., Shipulin G.A. The quantitative testing of V617F mutation in gen JAK2 using pyrosequencing technique. Klinicheskaia laboratornaia diagnostika. 2014; 59 (11): 60–63. (in Russian).Дрибноходова О.П., Миронов К.О., Дунаева Е.А., Маркелов М.Л., Войцеховская Я.А., Демидова И.А., Баринов А.А., Шипулин Г.А. Выявление активирующих соматических мутаций в гене KRAS методом пиросеквенирования. Клиническая лабораторная диагностика. 2013; 6: 49–51.Dribnokhodova O.P., Mironov K.O., Dunaeva E.A., Demidova I.A., Barinov A.A., Voiciehovskaya Ia.A., Markelov M.L., Shipulin G.A. The detection of activating somatic mutations in gene KRAS using pyrosequencing technique. Klinicheskaia laboratornaia diagnostika. 2013; 6: 49–51. (in Russian).Дунаева Е.А., Миронов К.О., Субботина Т.Н., Ольховский И.А., Шипулин Г.А. Разработка и сравнительная апробация методик для повышения чувствительности определения мутации V617F в гене JAK2 методом пиросеквенирования. Клиническая лабораторная диагностика. 2017; 62 (2): 125–128.Dunaeva E.A., Mironov K.O., Subbotina T.N., Olkhovsky I.A., Shipulin G.A. The development and comparative approbation of methods of increasing sensitivity of detection of mutation V617F in gene JAK2 by pyrosequencing. Klinicheskaia laboratornaia diagnostika. 2017; 62 (2): 125–128. (in Russian).Armbruster D.A., Pry T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin Biochem Rev. 2008 Aug; 29 Suppl 1(Suppl 1): S49–52.Armbruster D.A., Pry T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin Biochem Rev. 2008 Aug; 29 Suppl 1(Suppl 1): S49–52.Hou P., Liu D., Xing M. Functional characterization of the T1799- 1801del and A1799-1816ins BRAF mutations in papillary thyroid cancer. Cell Cycle. 2007 Feb 1; 6(3): 377–9. doi: 10.4161/cc.6.3.3818.Hou P., Liu D., Xing M. Functional characterization of the T1799- 1801del and A1799-1816ins BRAF mutations in papillary thyroid cancer. Cell Cycle. 2007 Feb 1; 6(3): 377–9. doi: 10.4161/cc.6.3.3818.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.