oncotomskСибирский онкологический журналSiberian journal of oncology1814-48612312-3168Tomsk National Research Medical Сепtеr of the Russian Academy of Sciences10.21294/1814-4861-2022-21-3-61-69oncotomsk-2164Research ArticleЛАБОРАТОРНЫЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯLABORATORY AND EXPERIMENTAL STUDIESОценка противоопухолевых, токсических эффектов и характера экспрессии генов-мишеней miR-204-5p при применении ее имитатора на модели меланомы В-16 in vivoAntitumor, toxicity and target gene expression evaluation of MiR-204-5p mimic application on melanoma b16-bearing micehttps://orcid.org/0000-0002-7226-9565ЛапкинаЕ. З.LapkinaE. Z.

Лапкина Екатерина Зиядхановна, кандидат биологических наук, доцент кафедры фармации с курсом ПО

660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1

Ekaterina Z. Lapkina, PhD, Associate Professor, Department of Pharmacy

1, Partizana Zheleznyak St., 660022, Krasnoyarsk

e.z.lapkina@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6801-3452ПалкинаН. В.PalkinаN. V.

Палкина Надежда Владимировна, кандидат медицинских наук, ассистент кафедры патологической физиологии им. проф.В.В. Иванова

660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1

Nadezhda V. Palkina, MD, PhD, Assistant, Department of Pathophysiology

1, Partizana Zheleznyak St., 660022, Krasnoyarsk

https://orcid.org/0000-0002-1284-6711АверчукА. С.AverchukA. S.

Аверчук Антон Сергеевич, кандидат биологических наук, доцент кафедры патологической физиологии им. проф. В.В. Иванова

660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1

Anton S. Averchuk, PhD, Associate Professor, Department of Pathophysiology

1, Partizana Zheleznyak St., 660022, Krasnoyarsk

https://orcid.org/0000-0001-6363-5941ЕсимбековаА. Р.EsimbekovaA. R.

Есимбекова Александра Рашидовна, ассистент кафедры патологической физиологии им. проф. В.В. Иванова

660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1

Alexandra R. Esimbekova, MD, Assistant, Department of Pathophysiology

1, Partizana Zheleznyak St., 660022, Krasnoyarsk

https://orcid.org/0000-0001-8142-4283РукшаТ. Г.RukshaT. G.

Рукша Татьяна Геннадьевна, доктор медицинских наук, заведующая кафедрой патологической физиологии им. проф.В.В. Иванова

660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1

Tatiana G. Ruksha, MD, DSc, Head of the Department of Pathophysiology

1, Partizana Zheleznyak St., 660022, Krasnoyarsk

ФГБОУ ВО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава РоссииРоссияV.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical UniversityRussian Federation2022290620222136169Copyright © Лапкина Е.З., Палкина Н.В., Аверчук А.С., Есимбекова А.Р., Рукша Т.Г., 20222022Лапкина Е.З., Палкина Н.В., Аверчук А.С., Есимбекова А.Р., Рукша Т.Г.Lapkina E.Z., Palkinа N.V., Averchuk A.S., Esimbekova A.R., Ruksha T.G.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.siboncoj.ru/jour/article/view/2164

Цель исследования – оценка влияния имитатора miR-204-5p на рост меланомы В-16 in vivo при внутрибрюшинном трехкратном его введении, определение изменения при этом экспрессии генов-мишеней miR-204-5p в опухоли и дистантных органах, а также выраженности токсических реакций.

Материал и методы

Материал и методы. Исследование проводили на мышах C57Bl/6 с подкожно перевитой меланомой B-16. Животным опытной группы внутрибрюшинно вводили имитатор микроРНК miR-204-5p (5нМоль) на 8, 10, 12-е сут после трансплантации опухолевых клеток. Согласно результатам биоинформатического анализа определяли уровень экспрессии генов-мишеней микроРНК BCL2 и SIRT1 методом ПЦР в реальном времени. Определяли токсический эффект воздействия имитатора по динамике массы тела и органов, объему опухолевого узла, изменению двигательной активности и внешнего вида животных в течение эксперимента.

Результаты

Результаты. Оценка внешних признаков и динамики двигательной активности животных, а также динамики их массы и массы органов при вскрытии свидетельствует об отсутствии токсического эффекта имитатора miR-204-5p. К 13–14-му дню эксперимента двигательная активность в контрольных группах животных статистически значимо снизилась по сравнению с группой животных, которым вводился имитатор miR-204-5p (р=0,011) Отмечено повышение экспрессии BCL2 в легких и почках мышей и SIRT1 – в легких мышей (p˂0,05). Отмечалась тенденция к снижению массы опухолевого узла к 14-му дню эксперимента.

Заключение

Заключение. Модуляция уровня микроРНК miR-204-5p приводит к изменению экспрессии генов-мишеней – SIRT1 и BCL2 в легких животных, BCL2 – в почках. Введение имитатора микроРНК не вызывает нарушений двигательной активности животных, изменения массы внутренних органов, что может свидетельствовать об отсутствии развития токсического эффекта. Дальнейшее исследование требуется для разъяснения биодоступности модуляторов микроРНК в опухолевую ткань, а также влияния имитатора miR-204-5p на пролиферацию клеток меланомы in vivo.

Objective. To evaluate anti-tumor, toxic effect of miR-204-5p mimic applicaton on melanoma B-16-bearing mice followed by miR-204-5p target gene expression estimation in melanoma tumor and distant organs. Material and Methods. C57Bl/6 melanoma B-16-bearing mice were used. The animals of the experimental group were intraperitoneally injected with a 5 nM miR-204-5p miRNA simulator (mimic) on the 8th, 10th, and 12th days after melanoma B-16 cell transplantation. Based on the results of bioinformatic analysis, miR-204-5p target genes BCL2 and SIRT1 expression levels were determined by quantitative real-time PCR. The toxic effect of miR-204-5p mimic was estimated by the evaluation of body weight, mass of the internal organs, and motor activity. Results. On the 13-14th days of the experiment, the motor activity of animals in the control groups decreased signifcantly compared to the group of animals treated by miR-204-5p. Target gene BCL2 showed increased expression in the lungs and kidneys and SIRT1 levels were increased in the lungs of miR-204-5p mimic treated animals (p˂0.05). Tumor mass tended to decrease in the animals treated by miR-204-5p mimic. Conclusion. Modulation of the level of miR-204-5p microRNA led to changes in the expression of SIRT1 and BCL2 in the lungs of animals, and changes in the expression of BCL2in the kidneys. MiR-204-5p mimic application did not have toxic effect on animals treated. Further studies are necessary to clarify miR-204-5p implication in melanoma cell proliferation regulation as well as it’s biodistibution in the tumor tissue.

меланома B-16B16miR-204-5pмикроРНкгены мишенибиоинформатический анализmelanoma B16miR-204-5pmicroRNAtarget genesbioinformatic analysisReferencesArozarena I., Wellbrock C. Phenotype plasticity as enabler of melanoma progression and therapy resistance. NatRevCancer. 2019. 19(7): 377–91. doi: 10.1038/s41568-019-0154-4.Arozarena I., Wellbrock C. Phenotype plasticity as enabler of melanoma progression and therapy resistance. NatRevCancer. 2019. 19(7): 377–91. doi: 10.1038/s41568-019-0154-4.Рукша Т.Г., Аксененко М.Б., Гырылова С.Н. Злокачественные новообразования кожи: анализ заболеваемости в Красноярском крае, проблемы профилактики и совершенствования ранней диагностики. Вестник дерматологии и венерологии. 2010. 4: 4–9.Ruksha T.G., Aksenenko M.B., Gyrylova S.N. Malignant skin neoplasms: analysis of the incidence rate in the Krasnoyarsk Territory, problems of prevention and improvement of early diagnostics. Herald of Dermatology and Venerology. 2010. 4: 4–9. (in Russian).Chen Z., Li Z., Soutto M., Wang W., Piazuelo M.B., Zhu S., Guo Y., Maturana M.J., Corvalan A.H., Chen X., Xu Z., El-Rifai W. Integrated analysis of mouse and human gastric neoplasm sidentifescon served microRNA network sin gastric carcinogenesis. Gastroenterology. 2019. 156(4): 1127–39. doi: 10.1053/j.gastro.2018.11.052.Chen Z., Li Z., Soutto M., Wang W., Piazuelo M.B., Zhu S., Guo Y., Maturana M.J., Corvalan A.H., Chen X., Xu Z., El-Rifai W. Integrated analysis of mouse and human gastric neoplasm sidentifescon served microRNA network sin gastric carcinogenesis. Gastroenterology. 2019. 156(4): 1127–39. doi: 10.1053/j.gastro.2018.11.052.Fasoulakis Z., Daskalakis G., Diakosavvas M., Papapanagiotou I., Theodora M., Bourazan A., Alatzidou D., Pagkalos A., Kontomanolis E.N. MicroRNAs Determining Carcinogenesis by Regulating Oncogenes and Tumor Suppressor Genes During Cell Cycle. MicroRNA. 2020; 9(2): 82–92. doi: 10.2174/2211536608666190919161849.Fasoulakis Z., Daskalakis G., Diakosavvas M., Papapanagiotou I., Theodora M., Bourazan A., Alatzidou D., Pagkalos A., Kontomanolis E.N. MicroRNAs Determining Carcinogenesis by Regulating Oncogenes and Tumor Suppressor Genes During Cell Cycle. MicroRNA. 2020; 9(2): 82–92. doi: 10.2174/2211536608666190919161849.Lee T.J., Yuan X., Kerr K., Yoo J.Y., Kim D.H., Kaur B., Eltzschig H.K. Strategies to Modulate MicroRNA Functions for the Treatment of Cancer or Organ Injury. Pharmacol Rev. 2020; 72(3): 639–67. doi: 10.1124/ pr.119.019026.Lee T.J., Yuan X., Kerr K., Yoo J.Y., Kim D.H., Kaur B., Eltzschig H.K. Strategies to Modulate MicroRNA Functions for the Treatment of Cancer or Organ Injury. Pharmacol Rev. 2020; 72(3): 639–67. doi: 10.1124/ pr.119.019026.Noori J., Sharif M., Haghjooy Javanmard S. miR-30a Inhibits Melanoma Tumor Metastasis by Targeting the E-cadherin and Zinc Finger E-box Binding Homeobox 2. Adv Biomed Res. 2018; 7: 143. doi: 10.4103/ abr.abr_146_18.Noori J., Sharif M., Haghjooy Javanmard S. miR-30a Inhibits Melanoma Tumor Metastasis by Targeting the E-cadherin and Zinc Finger E-box Binding Homeobox 2. Adv Biomed Res. 2018; 7: 143. doi: 10.4103/ abr.abr_146_18.Xu D., Chen X., He Q., Luo C. MicroRNA-9 suppresses the growth, migration, and invasion of malignant melanoma cells via targeting NRP1. Onco Targets Ther. 2016; 9: 7047–57. doi: 10.2147/OTT.S107235.Xu D., Chen X., He Q., Luo C. MicroRNA-9 suppresses the growth, migration, and invasion of malignant melanoma cells via targeting NRP1. Onco Targets Ther. 2016; 9: 7047–57. doi: 10.2147/OTT.S107235.Chen Y., Zhang Z., Luo C., Chen Z., Zhou J. MicroRNA-18b inhibits the growth of malignant melanoma via inhibition of HIF-1α-mediated glycolysis. Oncol Rep. 2016; 36(1): 471–9. doi: 10.3892/or.2016.4824.Chen Y., Zhang Z., Luo C., Chen Z., Zhou J. MicroRNA-18b inhibits the growth of malignant melanoma via inhibition of HIF-1α-mediated glycolysis. Oncol Rep. 2016; 36(1): 471–9. doi: 10.3892/or.2016.4824.Zhou J., Xu D., Xie H., Tang J., Liu R., Li J., Wang S., Chen X., Su J., Zhou X., Xia K., He Q., Chen J., Xiong W., Cao P., Cao K. miR-33a functions as a tumor suppressor in melanoma by targeting HIF-1α. Cancer Biol Ther. 2015; 16(6): 846–55. doi: 10.1080/15384047.2015.1030545.Zhou J., Xu D., Xie H., Tang J., Liu R., Li J., Wang S., Chen X., Su J., Zhou X., Xia K., He Q., Chen J., Xiong W., Cao P., Cao K. miR-33a functions as a tumor suppressor in melanoma by targeting HIF-1α. Cancer Biol Ther. 2015; 16(6): 846–55. doi: 10.1080/15384047.2015.1030545.Yang C.H., Yue J., Pfeffer S.R., Handorf C.R., Pfeffer L.M. MicroRNA miR-21 regulates the metastatic behavior of B16 melanoma cells. J Biol Chem. 2011; 286(45): 39172–8. doi: 10.1074/jbc.M111.285098.Yang C.H., Yue J., Pfeffer S.R., Handorf C.R., Pfeffer L.M. MicroRNA miR-21 regulates the metastatic behavior of B16 melanoma cells. J Biol Chem. 2011; 286(45): 39172–8. doi: 10.1074/jbc.M111.285098.Lai X., Wolkenhauer O., Vera J. Understanding microRNA-mediated gene regulatory networks through mathematical modelling. Nucleic Acids Res. 2016; 44(13): 6019–35. doi: 10.1093/nar/gkw550.Lai X., Wolkenhauer O., Vera J. Understanding microRNA-mediated gene regulatory networks through mathematical modelling. Nucleic Acids Res. 2016; 44(13): 6019–35. doi: 10.1093/nar/gkw550.He L., He X., Lim L.P., de Stanchina E., Xuan Z., Liang Y., Xue W., Zender L., Magnus J., Ridzon D., Jackson A.L., Linsley P.S., Chen C., Lowe S.W., Cleary M.A., Hannon G.J. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature. 2007; 447(7148): 1130–4. doi: 10.1038/nature05939.He L., He X., Lim L.P., de Stanchina E., Xuan Z., Liang Y., Xue W., Zender L., Magnus J., Ridzon D., Jackson A.L., Linsley P.S., Chen C., Lowe S.W., Cleary M.A., Hannon G.J. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature. 2007; 447(7148): 1130–4. doi: 10.1038/nature05939.Toda H., Kurozumi S., Kijima Y., Idichi T., Shinden Y., Yamada Y., Arai T., Maemura K., Fujii T., Horiguchi J., Natsugoe S., Seki N. Molecular pathogenesis of triple-negative breast cancer based on microRNA expression signatures: antitumor miR-204-5p targets AP1S3. J Hum Genetics. 2018. 63(12): 1197–210. doi: 10.1038/s10038-018-0510-3.Toda H., Kurozumi S., Kijima Y., Idichi T., Shinden Y., Yamada Y., Arai T., Maemura K., Fujii T., Horiguchi J., Natsugoe S., Seki N. Molecular pathogenesis of triple-negative breast cancer based on microRNA expression signatures: antitumor miR-204-5p targets AP1S3. J Hum Genetics. 2018. 63(12): 1197–210. doi: 10.1038/s10038-018-0510-3.Дубовцева И.Ю., Аксененко М.Б., Рукша Т.Г. Роль сиртуина 1 в регуляции клеток меланомы. Сибирский онкологический журнал. 2019; 18(6): 82–9.Dubovtseva I.Yu., Aksenenko M.V., Ruksha T.G. Role of sirtuin 1 in regulation of melanoma cell proliferation. Siberian Journal of Oncology. 2019; 18(6): 82–9. (in Russian). doi: 10.21294/1814-4861- 2019-18-6-82-89.Frenzel A., Grespi F., Chmelewskij W., Villunger A. Bcl2 family protein sincarcino genesis and the treatment of cancer. Apoptosis. 2009. 14: 584–96. doi: 10.1007/s10495-008-0300-z.Frenzel A., Grespi F., Chmelewskij W., Villunger A. Bcl2 family protein sincarcino genesis and the treatment of cancer. Apoptosis. 2009. 14: 584–96. doi: 10.1007/s10495-008-0300-z.Трещалина Е.М., Жукова О.С., Герасимова Г.К., Андронова Н.В., Гарин А.М. Методические рекомендации по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекарственных средств. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Ч. 1. М., 2012. С. 642–57.Treshchalina E.M., Zhukova O.S., Gerasimova G.K., Andronova N.V., Garin A.M. Guidelines for the preclinical study of the antitumor activity of drugs. Guidelines for conducting preclinical studies of drugs. Part 1. M., 2012. P. 642–57. (in Russian).Dunn R. Brexit: A Boon or a Curse for Animals Used in Scientifc Procedures? Animals (Basel). 2021; 11(6): 1547. doi: 10.3390/ ani11061547.Dunn R. Brexit: A Boon or a Curse for Animals Used in Scientifc Procedures? Animals (Basel). 2021; 11(6): 1547. doi: 10.3390/ ani11061547.Flecknell P. Replacement, reduction and refnement. ALTEX. 2002; 19(2): 73–8.Flecknell P. Replacement, reduction and refnement. ALTEX. 2002; 19(2): 73–8.Михеев А.А., Шмендель Е.В., Жестовская Е.С., Назаров Г.В., Маслов М.А. Катионные липосомы как средства доставки нуклеиновых кислот. Тонкие химические технологии. 2020. 15(1): 7–27.Mikheev A.A., Shmendel E.V., Zhestovskaya E.S., Nazarov G.V., Maslov M.A. Сationic liposomes as delivery systems for nucleic acids. Fine Chemical Technologies. 2020. 15(1): 7–27. (in Russian). doi:10.32362/2410-6593-2020-15-1-7-27.Schlosser K., Taha M., Stewart D.J. Systematic Assessmentof Strategies for Lung-targeted Delivery of MicroRNA Mimics. Theranostics. 2018. 8(5): 1213–26. doi: 10.7150/thno.22912.Schlosser K., Taha M., Stewart D.J. Systematic Assessmentof Strategies for Lung-targeted Delivery of MicroRNA Mimics. Theranostics. 2018. 8(5): 1213–26. doi: 10.7150/thno.22912.Liu L., Wang J., Li X., Ma J., Shi C., Zhu H., Xi Q., Zhang J., Zhao X., Gu M. MiR-204-5p suppresses cell proliferation by inhibiting IGFBP5 in papillary thyroid carcinoma. Biochem Biophys Res Commun. 2015; 457(4): 621–6. doi: 10.1016/j.bbrc.2015.01.037.Liu L., Wang J., Li X., Ma J., Shi C., Zhu H., Xi Q., Zhang J., Zhao X., Gu M. MiR-204-5p suppresses cell proliferation by inhibiting IGFBP5 in papillary thyroid carcinoma. Biochem Biophys Res Commun. 2015; 457(4): 621–6. doi: 10.1016/j.bbrc.2015.01.037.Wang X., Li F., Zhou X. miR-204-5p regulates cell proliferation and metastasis through inhibiting CXCR4 expression in OSCC. Biomed Pharmacother. 2016; 82: 202–7. doi: 10.1016/j.biopha.2016.04.060.Wang X., Li F., Zhou X. miR-204-5p regulates cell proliferation and metastasis through inhibiting CXCR4 expression in OSCC. Biomed Pharmacother. 2016; 82: 202–7. doi: 10.1016/j.biopha.2016.04.060.Xia Z., Liu F., Zhang J., Liu L. Decreased Expression of MiRNA204-5p Contributes to Glioma Progression and Promotes Glioma Cell Growth, Migration and Invasion. PLoS One. 2015; 10(7). doi: 10.1371/ journal.pone.0132399.Xia Z., Liu F., Zhang J., Liu L. Decreased Expression of MiRNA204-5p Contributes to Glioma Progression and Promotes Glioma Cell Growth, Migration and Invasion. PLoS One. 2015; 10(7). doi: 10.1371/ journal.pone.0132399.Palkina N., Komina A., Aksenenko M., Moshev A., Savchenko A., Ruksha T. miR-204-5p and miR-3065-5p exert antitumor efects on melanoma cells. Oncol Lett. 2018; 15(6): 8269–80. doi: 10.3892/ol.2018.8443.Palkina N., Komina A., Aksenenko M., Moshev A., Savchenko A., Ruksha T. miR-204-5p and miR-3065-5p exert antitumor efects on melanoma cells. Oncol Lett. 2018; 15(6): 8269–80. doi: 10.3892/ol.2018.8443.Палкина Н.В., Комина А.В., Аксененко М.Б., Белоногов Р.Н., Лаврентьев С.Н., Рукша Т.Г. Жизнеспособность клеток меланомы b16 in vitro и токсичность ингибитора mir-204-5p (lna™) in vivo при модуляции экспрессии mir-204-5p у мышей. Цитология. 2018. 60(3): 180–7.Palkina N.V., Komina A.V., Aksenenko M.B., Belonogov R.N., Lavrentev S.N., Ruksha T.G. Toxicity of mir-204-5p inhibition for melanoma b16 cells in vitro and mice in vivo. Cell and Tissue Biology. 2018. 60(3): 180–7. (in Russian).Ambros V. The functions of animal microRNAs. Nature. 2004; 431(7006): 350–5. doi: 10.1038/nature02871.Ambros V. The functions of animal microRNAs. Nature. 2004; 431(7006): 350–5. doi: 10.1038/nature02871.Place R.F., Li L.C., Pookot D., Noonan E.J., Dahiya R. MicroRNA-373 induces expression of genes with complementary promoter sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008; 105(5): 1608–13. doi: 10.1073/ pnas.0707594105.Place R.F., Li L.C., Pookot D., Noonan E.J., Dahiya R. MicroRNA-373 induces expression of genes with complementary promoter sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008; 105(5): 1608–13. doi: 10.1073/ pnas.0707594105.White P.J., Anastasopoulos F., Pouton C.W., Boyd B.J. Overcoming biological barriers to in vivo efcacy of antisense oligonucleotides. Expert Rev Mol Med. 2009; 11. doi: 10.1017/S1462399409001021.White P.J., Anastasopoulos F., Pouton C.W., Boyd B.J. Overcoming biological barriers to in vivo efcacy of antisense oligonucleotides. Expert Rev Mol Med. 2009; 11. doi: 10.1017/S1462399409001021.Vartanian A., Baryshnikova M., Burova O., Afanasyeva D., Misyurin V., Belyаvsky A., Shprakh Z. Inhibitor of vasculogenic mimicry restores sensitivity of resistant melanoma cells to DNA-damaging agents. Melanoma Res. 2017; 27(1): 8–16. doi: 10.1097/CMR.0000000000000308.Vartanian A., Baryshnikova M., Burova O., Afanasyeva D., Misyurin V., Belyаvsky A., Shprakh Z. Inhibitor of vasculogenic mimicry restores sensitivity of resistant melanoma cells to DNA-damaging agents. Melanoma Res. 2017; 27(1): 8–16. doi: 10.1097/CMR.0000000000000308.Григорьева И.Н., Бурова О.С., Степанова Е.В., Харатишвили Т.К., Барышников А.Ю. Способность клеточных линий метастатической меланомы кожи к васкулогенной мимикрии. Российский биотерапевтический журнал. 2010. 9(4): 97–102.Grigorieva I.N., Burova O.S., Stepanova E.V., Kharatishvili T.K., Baryshnikov A.Yu. Ability of metastatic cutaneous melanoma cell lines to vasculogenic mimicry. Russian Journal of Biotherapy. 2010. 9(4): 97–102. (in Russian).Courboulin A., Paulin R., Giguère N.J., Saksouk N., Perreault T., Meloche J., Paquet E.R., Biardel S., Provencher S., Côté J., Simard M.J., Bonnet S. Role for miR-204 in human pulmonary arterial hypertension. J Exp Med. 2011; 208(3): 535–48. doi: 10.1084/jem.20101812.Courboulin A., Paulin R., Giguère N.J., Saksouk N., Perreault T., Meloche J., Paquet E.R., Biardel S., Provencher S., Côté J., Simard M.J., Bonnet S. Role for miR-204 in human pulmonary arterial hypertension. J Exp Med. 2011; 208(3): 535–48. doi: 10.1084/jem.20101812.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.