Материал и методы

oncotomsk

Сибирский онкологический журнал

Siberian journal of oncology

1814-48612312-3168

Tomsk National Research Medical Сепtеr of the Russian Academy of Sciences

10.21294/1814-4861-2023-22-1-82-94

oncotomsk-2434

Research Article

ЛАБОРАТОРНЫЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

LABORATORY AND EXPERIMENTAL STUDIES

Разработка лабораторных моделей in vitro иммунного микроокружения опухоли для оценки параметров качества и специфической эффективности дендритно-клеточной вакцины

Development of in vitro laboratory models of the tumor immune microenvironment to evaluate quality parameters and specific efficacy of the dendritic cell vaccine

https://orcid.org/0000-0002-7826-4861

Нехаева

Т. Л.

Nekhaeva

T. L.

Нехаева Татьяна Леонидовна, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник научного отдела онкоиммунологии

197758, г. Санкт-Петербург, пос. Песочный, ул. Ленинградская, 68

SPIN-код: 5366-8969,

Researcher ID (WOS): L-7268-2018

Tatyana L. Nekhayeva, MD, PhD, Senior Researcher, Research Department of Cancer Immunology

68, Leningradskaya St., 197758, St. Petersburg, Pesochny village

Researcher ID (WOS): L-7268-2018

nehaevat151274@mail.ru

https://orcid.org/0000-0003-4796-0386

Данилова

А. Б.

Danilova

A. B.

Данилова Анна Борисовна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник научного отдела онкоиммунологии

197758, г. Санкт-Петербург, пос. Песочный, ул. Ленинградская, 68

SPINкод: 9387-8328,

Researcher ID (WOS): H-7828-2014

Anna B. Danilova, PhD, Senior Research Associate of the Scientific Department of Cancer Immunology

68, Leningradskaya St., 197758, St. Petersburg, Pesochny village

Researcher ID (WOS): H-7828-2014

https://orcid.org/0000-0002-2426-9843

Федорос

Е. И.

Fedoros

E. I.

Федорос Елена Ивановна, кандидат сельскохозяйственных наук, заведующая научной лабораторией канцерогенеза и старения

197758, г. Санкт-Петербург, пос. Песочный, ул. Ленинградская, 68

SPIN-код: 3302-1384,

Researcher ID (WOS): ABG-8750-2020

Elena I. Fedoros, PhD, Head of the Scientific Laboratory of Carcinogenesis and Aging

68, Leningradskaya St., 197758, St. Petersburg, Pesochny village

Researcher ID (WOS): ABG-8750-2020

https://orcid.org/0000-0002-3533-2721

Ефремова

Н. А.

Efremova

N. A.

Ефремова Наталья Александровна, научный сотрудник научного отдела онкоиммунологии

197758, г. Санкт-Петербург, пос. Песочный, ул. Ленинградская, 68

SPIN-код: 7352-9350,

Researcher ID (WOS): P-3886-2015,

Author ID (Scopus): 57194491563

Natalya A. Efremova, Researcher, Research Department of Cancer Immunology

68, Leningradskaya St., 197758, St. Petersburg, Pesochny village

Researcher ID (WOS): P-3886-2015,

Author ID (Scopus): 57194491563

https://orcid.org/0000-0002-0125-9263

Емельянова

Н. В.

Emelyanova

N. V.

Емельянова Наталья Викторовна, лаборант-исследователь научного отдела онкоиммунологии

197758, г. Санкт-Петербург, пос. Песочный, ул. Ленинградская, 68

SPIN-код: 3765-4666,

Researcher ID (WOS): E-4436-2019

Natalya V. Emelyanova, laboratory assistant-researcher of the Scientific Department of Cancer Immunology

68, Leningradskaya St., 197758, St. Petersburg, Pesochny village

Researcher ID (WOS): E-4436-2019

https://orcid.org/0000-0001-8642-0935

Блохина

М. Л.

Blokhina

M. L.

Блохина Марина Леонидовна, младший научный сотрудник научного отдела онкоиммунологии

197758, г. Санкт-Петербург, пос. Песочный, ул. Ленинградская, 68

SPIN-код: 6095-5662

Marina L. Blokhina, Junior Researcher, Research Department of Cancer Immunology

68, Leningradskaya St., 197758, St. Petersburg, Pesochny village

https://orcid.org/0000-0003-3589-5871

Юрова

М. Н.

Yurova

M. N.

Юрова Мария Николаевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник научной лаборатории канцерогенеза и старения

197758, г. Санкт-Петербург, пос. Песочный, ул. Ленинградская, 68

SPIN-код: 3497-5175,

Researcher ID (WOS): E-3913-2017

Maria N. Yurova, PhD, Senior Researcher, Research Laboratory of Carcinogenesis and Aging

68, Leningradskaya St., 197758, St. Petersburg, Pesochny village

Researcher ID (WOS): E-3913-2017

https://orcid.org/0000-0002-4755-9317

Тындык

М. Л.

Tyndyk

M. L.

Тындык Маргарита Леонидовна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник научной лаборатории канцерогенеза и старения

197758, г. Санкт-Петербург, пос. Песочный, ул. Ленинградская, 68

SPIN-код: 6349-0014,

Researcher ID (WOS): AAA-8919-2020

Margarita L. Tyndyk, PhD, Senior Researcher, Research Laboratory of Carcinogenesis and Aging

68, Leningradskaya St., 197758, St. Petersburg, Pesochny village

Researcher ID (WOS): AAA-8919-2020

https://orcid.org/0000-0002-7472-4613

Балдуева

И. А.

Baldueva

I. A.

Балдуева Ирина Александровна, доктор медицинских наук, заведующая научным отделом онкоиммунологии

197758, г. Санкт-Петербург, пос. Песочный, ул. Ленинградская, 68

SPIN-код: 7512-8789,

Researcher ID (WOS): H-9574-2014

Irina A. Baldueva, MD, DSc, Head of the Scientific Department of Cancer Immunology

68, Leningradskaya St., 197758, St. Petersburg, Pesochny village

Researcher ID (WOS): H-9574-2014

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава РоссииРоссияN.N. Petrov National Medical Oncology Research Center of the Ministry of Health of RussiaRussian Federation

2023

22022023

2218294

2023

Нехаева Т.Л., Данилова А.Б., Федорос Е.И., Ефремова Н.А., Емельянова Н.В., Блохина М.Л., Юрова М.Н., Тындык М.Л., Балдуева И.А.

Nekhaeva T.L., Danilova A.B., Fedoros E.I., Efremova N.A., Emelyanova N.V., Blokhina M.L., Yurova M.N., Tyndyk M.L., Baldueva I.A.

Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.

This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.

https://www.siboncoj.ru/jour/article/view/2434

Цель исследования ‒ разработка in vitro лабораторных моделей для оценки параметров качества и специфической эффективности дендритно-клеточной вакцины (ДКВ).

Материал и методы

Материал и методы. В исследование включены биологические образцы больных злокачественными новообразованиями, получавших вакцинотерапию на основе аутологичных дендритных клеток (ДК). Для индукции пролиферации антигенспецифических Т-лимфоцитов (n=227) использовали незрелые ДК (n=46) и зрелые ДК (n=56). Для изучения противоопухолевой цитотоксической активности in vitro генерированных ЦТЛ (n=18) использовали аутологичные опухолевые клетки меланомы кожи (n=10) или сарком (n=8) пациентов в аналитической системе xCELLigence®. Секрецию цитокинов и цитолитических белков изучали методом мультиплексного анализа, субпопуляционный состав эффекторных Т-лимфоцитов определяли методом проточной цитометрии.

Результаты

Результаты. В работе показано, что зрелые ДК (CD83+CD1a-) отличаются высокой экспрессией молекул, презентирующих антиген (HLA-DR) и обеспечивающих миграцию ДК в лимфатические узлы (CCR7), а также костимулирующих молекул CD80 и CD86, по сравнению с незрелыми ДК (CD83-CD1a+). Установлено, что индукция зрелыми ДК стимулирует рост относительного содержания пролиферирующих Т-клеток по сравнению со стимуляцией незрелыми ДК (р<0,001) и специфическим РТА+ опухолевым лизатом (р<0,001). При изучении цитотоксической активности эффекторных Т-лимфоцитов разработана 2D in vitro модель с использованием аналитической системы xCELLigence® и выявлено 2 типа взаимодействия: 1) лабораторная модель № 1 – снижение клеточного индекса (CI) культуры клеток аутологичной опухоли в присутствии активированных эффекторных Т-лимфоцитов; 2) лабораторная модель № 2 – отсутствие изменений CI культуры клеток аутологичной опухоли при ее кокультивировании с активированными эффекторными Т-клетками по сравнению с контролем (72 ч наблюдения). Результаты демонстрируют цитотоксическую активность антиген-специфических Т-лимфоцитов, что обусловлено высоким содержанием терминальнодифференцированных цитотоксических Т-лимфоцитов (TEMRA), ЦТЛ, продуцирующих GrB, и профилем секреции цитокинов.

Заключение

Заключение. Разработаны требования к качеству персонализированной аутологичной ДКВ, включающие контроль иммунофенотипических характеристик, проведена оценка функциональной активности Т-лимфоцитов при индукции зрелыми вакцинными ДК. Разработан лабораторный регламент количественной оценки цитотоксической активности антиген-специфических Т-лимфоцитов в отношении аутологичной опухоли с использованием аналитической системы xCELLigence®, что позволит проводить персонализированный мониторинг и может прогнозировать эффективность проводимого лечения ДКВ.

Purpose of the study

Purpose of the study: development of in vitro laboratory models to evaluate quality parameters and specific efficacy of dendritic cell vaccine (DCV).

Material and Methods

Material and Methods. Biological samples of malignant tumor patients treated with autologous dendritic cell vaccine (DC) were included into the study. Immature DCs (n=46) and mature DCs (n=56) were used to induce proliferation of antigen-specific T lymphocytes (n=227). Autologous tumor cells from skin melanoma (n=10) or sarcoma (n=8) patients in the xCELLigence® assay system were used to study the in vitro antitumor cytotoxic activity of generated CTLs (n=18). The secretion of cytokines and cytolytic proteins was studied by multiplex analysis. The subpopulation composition of effector T-lymphocytes was determined by flow cytometry.

Results

Results. We revealed that mature DCs (CD83+CD1a-) had a high expression of antigen presenting molecules (HLA-DR) and those providing migration of DCs into lymph nodes (CCR7) as well as costimulatory molecules CD80 and CD86 as compared to immature DCs (CD83-CD1a+). Induction of mature DCs was found to stimulate an increase in the relative content of proliferating T cells compared with stimulation of immature DCs (p<0.001) and specific PTA+ tumor lysate (p<0.001). When studying cytotoxic activity of effector T-lymphocytes, we developed 2D in vitro models using xCELLigence® analytical system and revealed 2 types of interaction: 1) in vitro model № 1 – decrease in cell index (CI) of autologous tumor cell culture in the presence of activated effector T lymphocytes; 2) in vitro model № 2 – no change in CI of autologous tumor cell culture when co-cultured with activated effector T cells compared to control (72 h observation). The results demonstrated cytotoxic activity of antigen-specific T lymphocytes due to high content of terminally differentiated cytotoxic T lymphocytes (TEMRA), GrB-producing CTLs, and cytokine secretion profile.

Conclusion

Conclusion. Requirements for the quality of personalized autologous DCs, including control of immunophenotypic characteristics were developed, and functional activity of Tlymphocytes during induction of mature vaccine DCs was evaluated. A laboratory procedure was developed for quantitative assessment of cytotoxic activity of antigen-specific T-lymphocytes against autologous tumor using the xCELLigence® analytical system, thus allowing for personalized monitoring and predicting the effectiveness of DСV treatment.

клеточный продуктпараметры качествараково-тестикулярные антигеныдендритные клеткиантиген-специфические Т-лимфоцитылабораторная модельxCELLigence

cell productquality parameterscancer testicular antigensdendritic cellsantigen-specific T-lymphocyteslaboratory modelxCELLigence

Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ в рамках научного проекта № 22-25-00723 (Соглашение №22-25-00723 от 29.12.2021)

This study was supported fnancially by the Russian Science Foundation within the scientifc project № 22- 25-00723 (Agreement № 22-25-00723 of 29.12.2021)

References1

Мельникова Е.В., Меркулова О.В., Чапленко А.А., Меркулов В.А. Дизайн доклинических исследований биомедицинских клеточных продуктов: особенности, ключевые принципы и требования. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2017; 17(3): 133–44.

Melnikova E.V., Merkulova O.V., Chaplenko A.A., Merkulov V.A. Design of preclinical studies of biomedical cell products: characteristics, key principles and requirements. BIOproducts. Prevention, diagnosis, treatment. 2017; 17(3): 133–44. (in Russian).

Тихомирова А.В., Горячев Д.В., Меркулов В.А., Лысикова И.В., Губенко А.И., Зебрев А.И., Соловьева А.П., Ромодановский Д.П., Мельникова Д.В. Доклинические и клинические аспекты разработки биомедицинских клеточных продуктов. Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. 2018; 8(1): 23–35. doi: 10.30895/1991-29192018-8-1-23-35.

Tikhomirova A.V., Goryachev D.V., Merkulov V.A., Lysikova I.V., Gubenko A.I., Zebrev A.I., Solovieva А.P., Romodanovsky D.P., Melnikova E.V. Preclinical and clinical aspects of the development of biomedical cell products. The Bulletin of the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products. 2018; 8(1): 23–35. (in Russian). doi: 10.30895/1991-29192018-8-1-23-35.

Seyhan A.A. Lost in translation: the valley of death across preclinical and clinical divide – identification of problems and overcoming obstacles. Transl Med Comm. 2019; 4(1). doi: 10.1186/s41231-019-0050-7.

Avdonkina N.A., Danilova A.B., Misyurin V.A., Prosekina E.A., Girdyuk D.V., Emelyanova N.V., Nekhaeva T.L., Gafton G.I., Baldueva I.A. Biological features of tissue and bone sarcomas investigated using an in vitro model of clonal selection. Pathology Res Pract. 2021 Jan; 217: 153214. doi: 10.1016/j.prp.2020.153214.

de Wolf C., van de Bovenkamp M., Hoefnagel M. Regulatory perspective on in vitro potency assays for human dendritic cells used in anti-tumor immunotherapy. Cytotherapy. 2018; 20(11): 1289–308. doi: 10.1016/j.jcyt.2018.07.006.

Buchholz M., Knauer J., Lehmann J., Hass M., Gargosky S. Qualification of the COSTIM assay to determine potency and use in clinical trials. Cytotherapy. 2013; 15(4). doi: 10.1016/j.jcyt.2013.01.197.

Lamano J.B., Ampie L., Choy W., Kesavabhotla K., DiDomenico J.D., Oyon D.E., Parsa A.T., Bloch O. Immunomonitoring in glioma immunotherapy: current status and future perspectives. J Neurooncol. 2016; 127(1): 1–13. doi: 10.1007/s11060-015-2018-4.

Park Y.S., Shin C., Hwang H.S., Zenke M., Han D.W., Kang Y.S., Ko K., Do Y., Ko K. In vitro generation of functional dendritic cells differentiated from CD34 negative cells isolated from human umbilical cord blood. Cell Biol Int. 2015; 39(9): 1080–6. doi: 10.1002/cbin.10490.

Нехаева Т.Л. Оптимизация аутологичных дендритно-клеточных вакцин для лечения больных злокачественными новообразованиями. Сибирский онкологический журнал. 2013; 3: 52–6.

Nehaeva T.L. Autologous dendritic cell vaccine optimization for therapy of patients with disseminated malignant neoplasms. Siberian Journal of Oncology. 2013; 3: 52–6. (in Russian).

Балдуева И.А., Данилова А.Б., Нехаева Т.Л., Авдонкина Н.А., Емельянова Н.В., Беляев А.М. Клеточный продукт для нагрузки и активации дендритных клеток человека. Патент РФ № 2714208. Опубл. 13.02.2020.

Baldueva I.A., Danilova A.B., Nekhaeva T.L., Avdonkina N.A., Emelyanova N.V., Belyaev A.M. Cellular product for loading and activating human dendritic cells. RF patent No. 2714208. Publ. 02/13/2020. (in Russian).

Freshney R.I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. John Wiley and Sons, 2015. 736 p.

Chiu C.H., Lei K.F., Yeh W.L., Chen P., Chan Y.S., Hsu K.Y., Chen A.C. Comparison between xCELLigence biosensor technology and conventional cell culture system for real-time monitoring human tenocytes proliferation and drugs cytotoxicity screening. J Orthop Surg Res. 2017; 12(1): 149. doi: 10.1186/s13018-017-0652-6.

Lewis D.M., Park K.M., Tang V., Xu Y., Pak K., Eisinger-Mathason T.S., Simon M.C., Gerecht S. Intratumoral oxygen gradients mediate sarcoma cell invasion. Proc Natl Acad Sci USA. 2016; 113(33): 9292–7. doi: 10.1073/pnas.1605317113.

Нехаева Т.Л., Емельянова Н.В., Осипчук А.В., Блохина М.Л., Семёнов А.Л., Скачкова О.В., Данилова А.Б., Новик А.В., Авдонкина Н.А., Просекина Е.А., Пипиа Н.П., Зозуля А.Ю., Водолажский Д.И., Балдуева И.А. Адаптация метода оценки Т-клеточной пролиферации при изучении специфического противоопухолевого иммунного ответа на дендритно-клеточную вакцину на основе раково-тестикулярных антигенов in vitro. Материалы VI Петербургского международного онкологического форума «Белые ночи 2020». СПб., Вопросы онкологии. С. 143.

Нехаева Т.Л., Карпов А.Е., Пипиа Н.П. Поиск иммунотерапевтических мишеней в онкологии при формировании иммунологического синапса. Вопросы онкологии. 2021; 67(3): 344–9. doi: 10.37469/0507-3758-2021-673-344-349.

Cunningham S., Hackstein H. Recent Advances in Good Manufacturing Practice-Grade Generation of Dendritic Cells. Transfus Med Hemother. 2020; 47(6): 454–63. doi: 10.1159/000512451.

Tai Y., Wang Q., Korner H., Zhang L., Wei W. Molecular Mechanisms of T Cells Activation by Dendritic Cells in Autoimmune Diseases. Front Pharmacol. 2018; 9: 642. doi: 10.3389/fphar.2018.00642.

Binnewies M., Mujal A.M., Pollack J.L., Combes A.J., Hardison E.A., Barry K.C., Tsui J., Ruhland M.K., Kersten K., Abushawish M.A., Spasic M., Giurintano J.P., Chan V., Daud A.I., Ha P., Ye C.J., Roberts E.W., Krummel M.F. Unleashing Type-2 Dendritic Cells to Drive Protective Antitumor CD4+ T Cell Immunity. Cell. 2019; 177(3): 556–71. doi: 10.1016/j.cell.2019.02.005.

Passeri L., Marta F., Bassi V., Gregori S. Tolerogenic Dendritic Cell-Based Approaches in Autoimmunity. Int J Mol Sci. 2021; 22(16): 8415. doi: 10.3390/ijms22168415.

Данилова А.Б., Нехаева Т.Л., Ефремова Н.А., Новик А.В., Зозуля А.Ю., Гафтон Г.И., Балдуева И.А. Оценка эффективности использования тумороидов для индивидуального подбора лекарственной терапии солидных опухолей. Вопросы онкологии. 2021; 67(6): 815–28. doi: 10.37469/0507-3758-2021-67-6-815-828.

Danilova A.B., Nekhaeva T.L., Efremova N.A., Novik A.V., Zozulya A.Yu., Gafton G.I., Baldueva I.A. Assessment of the effectiveness of the use of tumoroids for personalized drug therapies for solid tumors. Problems in Oncology. 2021; 67(6): 815–28. (in Russian)]. doi: 10.37469/0507-3758-2021-67-6-815-828.

Danilova A.B., Efremova N.A., Murashkina A.A., NekhaevaT.L., Maydin M.A., Artemyeva E.S., Artemyeva A.S., Baldueva I.A. Evolution of the Solid Human Tumor Cells Properties in Various Experimental Systems in Vitro. J Hematol Oncol Res. 2022; 4(2): 9–29. doi: 10.14302/issn.2372-6601.jhor-22-4061.

Pham P.V., Le H.T., Vu B.T., Pham V.Q., Le P.M., Phan N.L., Trinh N.V., Nguyen H.T., Nguyen S.T., Nguyen T.L., Phan N.K. Targeting breast cancer stem cells by dendritic cell vaccination in humanized mice with breast tumor: preliminary results. Onco Targets Ther. 2016; 9: 4441–51. doi: 10.2147/OTT.S105239.

Ya G., Ren W., Qin R., He J., Zhao S. Role of myeloid-derived suppressor cells in the formation of pre-metastatic niche. Front Oncol. 2022; 12. doi: 10.3389/fonc.2022.975261.

Riegel K., Yurugi H., Schlöder J., Jonuleit H., Kaulich M., Kirschner F., Arnold-Schild D., Tenzer S., Schild H., Rajalingam K. ERK5 modulates IL-6 secretion and contributes to tumor-induced immune suppression. Cell Death Dis. 2021; 12(11): 969. doi: 10.1038/s41419-021-04257-8.

Binnewies M., Roberts E.W., Kersten K., Chan V., Fearon D.F., Merad M., Coussens L.M., Gabrilovich D.I., Ostrand-Rosenberg S., Hedrick C.C., Vonderheide R.H., Pittet M.J., Jain R.K., Zou W., Howcroft T.K., Woodhouse E.C., Weinberg R.A., Krummel M.F. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nat Med. 2018; 24(5): 541–50. doi: 10.1038/s41591-018-0014-x.

Lippitz B.E., Harris R.A. Cytokine patterns in cancer patients: A review of the correlation between interleukin 6 and prognosis. Oncoimmunology. 2016; 5(5). doi: 10.1080/2162402X.2015.1093722.

Schupp J., Krebs F.K., Zimmer N., Trzeciak E., Schuppan D., Tuettenberg A. Targeting myeloid cells in the tumor sustaining microenvironment. Cell Immunol. 2019; 343. doi: 10.1016/j.cellimm.2017.10.013.

Stephen B., Hajjar J. Overview of Basic Immunology for Clinical Investigators. Adv Exp Med Biol. 2017; 995: 1–31. doi: 10.1007/978-3319-53156-4_1.

Belli C., Trapani D., Viale G., D’Amico P., Duso B.A., Della Vigna P., Orsi F., Curigliano G. Targeting the microenvironment in solid tumors. Cancer Treat Rev. 2018; 65: 22–32. doi: 10.1016/j.ctrv.2018.02.004.

Stakheyeva M., Patysheva M., Kaigorodova E., Zavyalova M., Tarabanovskaya N., Choynzonov E., Cherdyntseva N. Tumor Properties Mediate the Relationship between Peripheral Blood Monocytes and Tumor-Associated Macrophages in Breast Cancer. Cancer Invest. 2022; 40(5): 442–56. doi: 10.1080/07357907.2021.2016803.

Данилова А.Б., Новик А.В., Нехаева Т.Л., Балдуева И.А. Роль факторов иммуносупрессии в прогнозе эффективности клеточной иммунотерапии у пациентов с солидными опухолями. Эффективная фармакотерапия. 2022; 18(17): 8–17. doi: 10.33978/2307-3586-2022-18-17-8-17.

Danilova A.B., Novik A.V., Nekhaeva T.L., Baldueva I.A. The role of immunosuppressive factors in the prognosis of cellular therapy efficacy in patients with solid tumors. Effective Pharmacotherapy. 2022; 18(17): 8–17. (in Russian). doi: 10.33978/2307-3586-2022-18-17-8-17.

Fridman W.H., Zitvogel L., Sautès-Fridman C., Kroemer G. The immune contexture in cancer prognosis and treatment. Nat Rev Clin Oncol. 2017; 14(12): 717–34. doi: 10.1038/nrclinonc.2017.101.

Cassioli C., Baldari C.T. The Expanding Arsenal of Cytotoxic T Cells. Front Immunol. 2022; 13. doi: 10.3389/fimmu.2022.883010.

Voskoboinik I., Whisstock J.C., Trapani J.A. Perforin and granzymes: function, dysfunction and human pathology. Nat Rev Immunol. 2015; 15(6): 388–400. doi: 10.1038/nri3839.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.