oncotomskСибирский онкологический журналSiberian journal of oncology1814-48612312-3168Tomsk National Research Medical Сепtеr of the Russian Academy of Sciences10.21294/1814-4861-2016-15-4-50-55oncotomsk-386Research ArticleЛАБОРАТОРНЫЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯLABORATORY AND EXPERIMENTAL STUDIESСИСТЕМА ТИОРЕДОКСИНА В РЕГУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРАЦИИ КЛЕТОК ЛИНИИ MCF-7 ПРИ МОДУЛЯЦИИ РЕДОКС-СТАТУСАTHE THIOREDOXIN SYSTEM IN REGULATING MCF-7 CELL PROLIFERATION UNDER REDOX STATUS MODULATIONСтеповаяЕ. А.StepovayaE. A.

Степовая Елена Алексеевна, доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры биохимии и молекулярной биологии с курсом клинической лабораторной диагностики

SPIN-код: 5562-4522

Stepovaya Elena A., MD, DSc, Professor, Department of Biochemistry and Molecular Biology with the Course of Clinical Laboratory Diagnostics 

SPIN-code: 8125-6414

muir@mail.ruШахристоваЕ. В.ShakhristovaE. V.

Шахристова Евгения Викторовна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры биохимии и молекулярной биологии с курсом клинической лабораторной диагностики, руководитель НОЦ молекулярной медицины 

SPIN-код: 8125-6414

Shakhristova Evgeniya V., MD, PhD, Associate Professor of the Department of Biochemistry and Molecular Biology with the Course of Clinical Laboratory Diagnostics, Head of the Laboratory of Molecular Medicine 

SPIN-code: 8125-6414

shaxristova@yandex.ruРязанцеваН. В.RyazantsevaN. V.

Рязанцева Наталья Владимировна, доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры биофизики Института фундаментальной биологии и биотехнологии, Сибирский федеральный университет; профессор кафедры биологической химии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого 

SPIN-код: 9162-0832

Ryazantseva Natalya V., MD, DSc, Professor of the Department of Biophysics, Siberian Federal University (Krasnoyarsk), Professor of the Department of Biological Chemistry with Courses of Medical, Pharmaceutical and Toxicological Chemistry, Krasnoyarsk State Medical University named after Professor V.F. Voino-Yasenetskyphysics

SPIN-код: 9162-0832. 

НосареваО. Л.NosarevaO. L.

Носарева Ольга Леонидовна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры биохимии и молекулярной биологии с курсом клинической лабораторной диагностики 

SPIN-код: 5688-7566

Nosareva Оlga L., MD, PhD, Associate Professor of the Department of Biochemistry and Molecular Biology with the Course of Clinical Laboratory Diagnostics 

SPIN-code: 5688-7566

olnosareva@yandex.ruЧильчигашевР. И.Chil’chigashevR. I.

Чильчигашев Роман Игоревич, студент 6-го курса медико-биологического факультета 

SPIN-код: 9129-5612

Chilchigashev Roman I., University undergraduate, Medical Biological Faculty atory Diagnostics 

SPINcode: 9129-5612

romchil@mail.ruЕгороваМ. Ю.EgorovaM. Yu.

Егорова Мария Юрьевна, студентка 2-го курса лечебного факультета 

SPIN-код: 4937

Egorova Mariya Yu., 2-nd-year student of General Medicine Faculty atory Diagnostics 

SPIN-code: 9129-5612

masha_dasha@mail.ruСибирский государственный медицинский университет, ТомскРоссияSiberian State Medical University, TomskRussian FederationСибирский федеральный университет, Красноярск; Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого, КрасноярскРоссияSiberian Federal University, Krasnoyarsk; Krasnoyarsk State Medical University named after Professor V.F. Voino-Yasenetsky, KrasnoyarskRussian Federation2016291020161545055Copyright © Степовая Е.А., Шахристова Е.В., Рязанцева Н.В., Носарева О.Л., Чильчигашев Р.И., Егорова М.Ю., 20162016Степовая Е.А., Шахристова Е.В., Рязанцева Н.В., Носарева О.Л., Чильчигашев Р.И., Егорова М.Ю.Stepovaya E.A., Shakhristova E.V., Ryazantseva N.V., Nosareva O.L., Chil’chigashev R.I., Egorova M.Y.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.siboncoj.ru/jour/article/view/386Введение

Введение. Несмотря на имеющиеся данные о функционировании опухолевых клеток в условиях свободнорадикального окисления, остается открытым вопрос о механизмах редокс-регуляции, управления пролиферацией клеток и «ускользания» от апоптотической гибели.

Цель исследования – выявить участие системы тиоредоксина в регуляции пролиферации клеток аденокарциномы молочной железы линии МСF-7 при модуляции редокс-статуса блокатором SH-групп белков и пептидов N-этилмалеимидом и протектором тиоловых групп – 1,4-дитиоэритритолом.

Материал и методы

Материал и методы. Исследования были выполнены с использованием опухолевой клеточной линии МСF-7, культивируемой адгезионным методом. Редокс-статус клеток модулировали с помощью5 мМ N-этилмалеимида, блокатора SH-групп белков и пептидов, и5 мМ 1,4-дитиоэритритола, протектора тиоловых групп. Оценку содержания активных форм кислорода и клеточного цикла проводили методом проточной цитофлуориметрии. Концентрацию восстановленного окисленного глутатиона и активность тиоредоксинредуктазы определяли спектрофотометрическим методом. Внутриклеточное содержание тиоредоксина, циклина Е и циклинзависимой киназы 2 определяли методом вестерн-блоттинга.

Результаты

Результаты. Показана важная роль системы тиоредоксина в регуляции пролиферации клеток линии МСF-7. Остановка клеточного цикла в S фазе при действии N-этилмалеимида и в G0/G1 фазе при действии 1,4-дитиоэритритола связана с изменениями активности редокс-чувствительных белковых комплексов, регулирующих пролиферацию (циклинов и циклинзависимых киназ).

Заключение

Заключение. Редокс-зависимая модуляция функционирования внутриклеточных белков, регулирующих пролиферацию, осуществляется при участии системы тиоредоксина. Данное направление исследований представляется перспективным для поиска молекулярных мишеней опухолевой трансформации клеток молочной железы.

Introduction

Introduction. Despite the available data on tumor cell functioning under the conditions of free radical-mediated oxidation, the mechanisms of redox regulation, cell proliferation management and apoptosis avoidance remain understudied.

The objective of the study was to identify the role of the thioredoxin system in regulating MCF-7 breast cancer cell proliferation under redox status modulation with 1.4-dithioerythritol.

Material and methods

Material and methods. The studies were conducted on the MCF-7 breast cancer cell line, grown in adherent cell culture. Cell redox status was modulated with5 mM N-ethylmaleimide – an SH group and peptide inhibitor and5 mM 1.4-dithioerythritol – a thiol group protector. The cell cycle was evaluated by flow cytometry, the same technique was used to measure the reactive oxygen species concentration. The levels of reduced and oxidized glutathione and the activity of thioredoxin reductase were identified by spectrophotometry. The intracellular concentrations of thioredoxin, cyclin E and cyclin-dependent kinase 2 were determined by Western blot analysis.

Results and discussion

Results and discussion. The essential role of the thioredoxin system in regulating MCF-7 breast cancer cell proliferation was exhibited. S-phase arrest under the effect of N-ethylmaleimide and G0/G1-phase arrest under the effect of 1.4-dithioerythritol are associated with the changes in the activity of redox-sensitive protein complexes (cyclins and cyclin-dependent kinases) that regulate cell proliferation.

Conclusion

Conclusion. Redoxdependent modulation of proliferation regulating intracellular protein activity occurs due to the thioredoxin system. This is a promising research area for seeking molecular targets of breast cell malignization. 

окислительный стрессредокс-статус клетоктиоредоксинаденокарцинома молочной железыпролиферацияoxidative stresscell redox statusthioredoxinbreast adenocarcinoma cellsproliferationРоссийский гуманитарный научный фонд (проект № 15-36-01289).ReferencesМеньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин В.З., Бондарь И.А., Труфакин В.А. Окислительный стресс: Патологические состояния и заболевания. Новосибирск; 2008. 284 с.Menshchikova E.B., Zenkov N.K., Lankin V.Z., Bondar I.A., Trufakin V.A. Oxidative stress: Pathological conditions and diseases. Novosibirsk, 2008. 284 р. [in Russian]Murphy M.P., Holmgren A., Larsson N.G., Halliwell B., Chang C.J., Kalyanaraman B., Rhee S.G., Thornalley P.J., Partridge L., Gems D., Nystrom T., Belousov V., Schumacker P.T., Winterbourn C.C. Unraveling the biological roles of reactive oxygen species. Cell Metab. 2011; 13 (4): 361–366. doi: 10.1016/j.cmet.2011.03.010.Murphy M.P., Holmgren A., Larsson N.G., Halliwell B., Chang C.J., Kalyanaraman B., Rhee S.G., Thornalley P.J., Partridge L., Gems D., Nyström T., Belousov V., Schumacker P.T., Winterbourn C.C. Unraveling the biological roles of reactive oxygen species. Cell Metab. 2011; 13 (4): 361–366. doi: 10.1016/j.cmet.2011.03.010.Ryazantseva N.V., Stepovaya E.A., Nosareva O.L., Konovalova E.V., Orlov D.S., Naumova A.I., Didenko S.A., Vesnina O.N., Shakhristova E.V., Zima A.P., Novitskii V.V. Role of heat shock protein 27 in regulation of glutathione system and apoptosis of Jurkat tumor cells and blood lymphocytes. Bull Exp Biol Med. 2015; 158 (3): 377–379. doi: 10.1007/ s10517-015-2766-3.Ryazantseva N.V., Stepovaya E.A., Nosareva O.L., Konovalova E.V., Orlov D.S., Naumova A.I., Didenko S.A., Vesnina O.N., Shakhristova E.V., Zima A.P., Novitskii V.V. Role of heat shock protein 27 in regulation of glutathione system and apoptosis of Jurkat tumor cells and blood lymphocytes. Bull. Exp. Biol. Med. 2015; 158 (3): 377–379. doi: 10.1007/ s10517-015-2766-3.Shakhristova E.V., Stepovaya E.A., Ryazantseva N.V., Nosareva O.L., Yakushina V.D., Ivanov V.V., Novitskii V.V. Role of Glutathione System Redox Potential in Apoptosis Dysregulation in MCF-7 Breast Adenocarcinoma. Bull Exp Biol Med. 2016; 160 (3): 364–367. doi: 10.1007/s10517-016-3172-1.Shakhristova E.V., Stepovaya E.A., Ryazantseva N.V., Nosareva O.L., Yakushina V.D., Ivanov V.V., Novitskii V.V. Role of Glutathione System Redox Potential in Apoptosis Dysregulation in MCF-7 Breast Adenocarcinoma. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2016; 160 (3): 364–367. doi: 10.1007/s10517-016-3172-1.Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток (жизнь и смерть, созидание и разрушение): физиологические и клинико-биохимические аспекты. СПб., 2006. 397 с.Dubininа E.E. Products of metabolism of oxygen in the functional activity of cells (life and death, creation and destruction). Physiological and clinical-biochemical aspects. SPb.; 2006. 397 р. [in Russian]Калинина Е.В., Чернов Н.Н., Алеид Р., Новичкова М.Д., Саприн А.Н., Березов Т.Т. Современные представления об антиоксидантной роли глутатиона и глутатионзависимых ферментов. Вестник Российской академии медицинских наук. 2010; 3: 46–54.Kalinina E.V., Chernov N.N., Aleid R., Novichkova M.D., Saprin A.N., Berezov T.T Sovremennye predstavlenija ob antioksidantnoj roli glutationa i glutationzavisimyh fermentov. Vestnik Rossijskoj AMN. 2010; 3: 46–54. [in Russian]Калинина Е.В., Чернов Н.Н., Саприн А.Н. Участие тио-, пероксии глутаредоксинов в клеточных редокс-зависимых процессах. Успехи биологической химии. 2008; 48: 319–358.Kalinina E.V., Chernov N.N., Saprin A.N. Uchastie tio-, peroksii glutaredoksinov v kletochnykh redoks-zavisimykh protsessakh. Uspekhi biologicheskoj khimii. 2008; 48: 319–358. [in Russian]Ray P.D., Huang B.W., Tsuji Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling. Cell Signal. 2012; 24 (5): 981–990. doi: 10.1016/j.cellsig.2012.01.008.Ray P.D., Huang B.W., Tsuji Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling. Cell Signal. 2012; 24 (5): 981–990. doi: 10.1016/j.cellsig.2012.01.008.Sahaf B., Heydari K., Herzenberg L.A. Lymphocyte surface thiol levels. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100 (7): 4001–4005.Sahaf B., Heydari K., Herzenberg L.A. Lymphocyte surface thiol levels. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100 (7): 4001–4005.Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analyt. Biochem. 1976; 7 (1, 2): 248–254.Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analyt. Biochem. 1976; 7 (1, 2): 248–254.Anderson M.E. Determination of glutathione and glutathione sulfide in biological samples. Methods Enzymol. 1985; 113: 548–555.Anderson M.E. Determination of glutathione and glutathione sulfide in biological samples. Methods Enzymol. 1985; 113: 548–555.Rahman I., Kode A., Biswas S.K. Assay for quantitative determination of glutathione and glutathione disulfide levels using enzymatic recycling method. Nat. Protoc. 2006; 1 (6): 3159–3165.Rahman I., Kode A., Biswas S.K. Assay for quantitative determination of glutathione and glutathione disulfide levels using enzymatic recycling method. Nat. Protoc. 2006; 1 (6): 3159–3165.Tamura T., Stadtman T.C. A new selenoprotein from human lung adenocarcinoma cells: рurification, properties, and thioredoxin reductase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996; 93: 1006–1011.Tamura T., Stadtman T.C. A new selenoprotein from human lung adenocarcinoma cells: рurification, properties, and thioredoxin reductase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996; 93: 1006–1011.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.