oncotomskСибирский онкологический журналSiberian journal of oncology1814-48612312-3168Tomsk National Research Medical Сепtеr of the Russian Academy of Sciences10.21294/1814-4861-2016-15-6-42-47oncotomsk-445Research ArticleЛАБОРАТОРНЫЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯLABORATORY AND EXPERIMENTAL STUDIESМЕХАНИЗМЫ ДИЗРЕГУЛЯЦИИ АПОПТОЗА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ЛИНИИ Р19 В УСЛОВИЯХ МОДУЛЯЦИИ РЕДОКС-СТАТУСАMECHANISMS OF APOPTOSIS DYSREGULATION IN CANCER CELLS UNDER THE CONDITIONS OF REDOX STATUS MODULATIONОрловД. С.OrlovD. S.

Орлов Дмитрий Сергеевич - интерн кафедры биохимии и молекулярной биологии с курсом клинической лабораторной диагностики.

634050, г. Томск, Московский тракт, 2. E-mail: DOC_esperanzo@ mail.ru. SPIN-код: 3625-3717

Orlov Dmitry S. - MD, intern, Department of Biochemistry and Molecular Biology with a Course of Clinical Laboratory Diagnostics.

2, Moskovsky Tract, 634050-Tomsk, Russia. E-mail: DOC_esperanzo@mail.ru. SPIN-code: 3625-3717

DOC_esperanzo@mail.ruРязанцеваН. В.RyazantsevaN. V.

Рязанцева Наталья Владимировна - доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории биолюминесцентных биотехнологий, институт фундаментальной биологии и биотехнологии, СФУ; профессор кафедры биологической химии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, КГМУ имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого.

E-mail: nv_ryazan@mail.ru. SPIN-код: 9162-0832

Ryazantseva Natalia V. - MD, DSc, Professor, Principal Investigator, Laboratory of Bioluminescent Biotechnology, Institute of Molecular Biology and Biotechnology, SFU; Department of Biological Chemistry with Courses of Medical, Pharmaceutical and Toxicological Chemistry, KSMUnamed after Professor V.F. Voino-Yasenetsky.

2, Moskovsky Tract, 634050-Tomsk, Russia. E-mail: nv_ryazan@mail.ru. SPIN-code: 9162-0832

nv_ryazan@mail.ruСтеповаяЕ. А.StepovayaE. A.

Степовая Елена Алексеевна - доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры биохимии и молекулярной биологии с курсом клинической лабораторной диагностики.

634050, г. Томск, Московский тракт, 2. E-mail: muir@mail.ru. SPIN-код: 5562

Stepovaya Elena A. - MD, DSc, Professor, Department of Biochemistry and Molecular Biology with a Course of Clinical Laboratory Diagnostics.

2, Moskovsky Tract, 634050-Tomsk, Russia. E-mail: muir@mail.ru. SPIN-code: 5562-4522

muir@mail.ruНосареваО. Л.NosarevaO. L.

Носарева Ольга Леонидовна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры биохимии и молекулярной биологии с курсом КЛД.

634050, г. Томск, Московский тракт, 2. E-mail: olnosareva@yandex.ru. SPIN-код: 5688-7566

Nosareva Olga L. - MD, PhD, Associate Professor of the Department of Biochemistry and Molecular Biology with a Course of Clinical Laboratory Diagnostics.

olnosareva@yandex.ruШахристоваЕ. ВShakhristovaE. V.

Шахристова Евгения Викторовна - кандидат медицинских наук, доцент кафедры биохимии и молекулярной биологии с курсом клинической лабораторной диагностики, руководитель НОЦ молекулярной медицины, СГМУ.

634050, г. Томск, Московский тракт, 2. E-mail: shaxristova@yandex.ru. SPIN-код: 8125-6414

Shakhristova Evgenia V. - MD, PhD, Associate Professor of the Department of Biochemistry and Molecular Biology with a Course of Clinical Laboratory Diagnostics, Head of Science and Education Center of Molecular Medicine.

2, Moskovsky Tract, 634050-Tomsk, Russia. E-mail: shaxristova@yandex.ru. SPIN-code: 8125-6414

shaxristova@yandex.ruИвановВ. В.IvanovV. V.

Иванов Владимир Владимирович - кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимии и молекулярной биологии с курсом КЛД, заведующий лабораторией биологических моделей.

634050, г. Томск, Московский тракт, 2. E-mail: ivanovvv1953@gmail.com. SPIN-код: 4961-9959

Ivanov Vladimir V. - PhD, Associate Professor of the Department of Biochemistry and Molecular Biology with a Course of Clinical Laboratory Diagnostics, Head of Laboratory of Biological Models .

2, Moskovsky Tract, 634050-Tomsk, Russia. E-mail: ivanovvv1953@gmail.com. SPIN-code: 4961-9959

ivanovvv1953@gmail.comСибирский государственный медицинский университетРоссияSiberian State Medical UniversityRussian FederationСибирский федеральный университет; Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-ЯсенецкогоРоссияSiberian Federal University; Krasnoyarsk State Medical University named after Professor V.F. Voino-YasenetskyRussian Federation2016291220161564247Copyright © Орлов Д.С., Рязанцева Н.В., Степовая Е.А., Носарева О.Л., Шахристова Е.В., Иванов В.В., 20162016Орлов Д.С., Рязанцева Н.В., Степовая Е.А., Носарева О.Л., Шахристова Е.В., Иванов В.В.Orlov D.S., Ryazantseva N.V., Stepovaya E.A., Nosareva O.L., Shakhristova E.V., Ivanov V.V.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.siboncoj.ru/jour/article/view/445

Введение. Изменение редокс-статуса опухолевых клеток может использоваться как один из молекулярных механизмов регуляции апоптоза, нацеленный на повышение восприимчивости опухолевых клеток к действию химиотерапевтических агентов. Цель исследования – изучение механизмов дизрегуляции апоптоза опухолевых клеток линии Р19 в условиях модуляции редокс-статуса. материал и методы. В ходе проведенного исследования комплексную оценку апоптоза в клетках опухолевой линии Р19 осуществляли методом проточной цитофлюориметрии. Определяли количество аннексинположительных клеток, экспрессию CD95 и CD120, а также процент клеток со сниженным трансмембранным потенциалом и внутриклеточную концентрацию ионов кальция. Содержание белковосвязанного глутатиона и величину соотношения восстановленной формы трипептида к окисленной определяли спектрофотометрическим методом. Для модуляции редокс-статуса использовали блокатор или протектор SH-групп, либо N-ацетилцистеин. результаты. Инкубация культуры в присутствии блокатора SH-групп приводила к дисбалансу системы глутатиона на фоне увеличения содержания его фракции, связанной с белками. Снижение редокс-статуса приводило к увеличению экспрессии CD95 и CD120 на мембране опухолевых клеток линии Р19, а также к снижению митохондриального потенциала и повышению внутриклеточной концентрации ионов кальция, что способствовало запуску апоптоза. Количество аннексин-положительных клеток увеличивалось при действии блокатора SH-групп и в присутствии N-ацетилцистеина. Заключение. В опухолевых клетках линии Р19 на фоне развития окислительного стресса выявлены молекулярные редокс-зависимые механизмы дизрегуляции апоптоза по митохондриальному и рецепторопосредованному пути.

Introduction. Changes in the redox status of tumor cells can be used as one of the molecular mechanisms of apoptosis aimed at increasing the susceptibility of tumor cells to chemotherapeutic agents. Purpose: to study the mechanisms of dysregulation of apoptosis in P19 tumor cells under the conditions of redox status modulation. Material and methods. Apoptosis in P19 tumor cells was assessed by flow cytometry analysis. The number of annexin-positive cells, the expression of CD95 and CD120, as well as the intracellular calcium ion concentration and the percentage of cells with reduced mitochondrial transmembrane potential were measured. The protein-glutathione mixed-disulfide level and the GSH/GSSG ratio were determined by spectrophotometry. To modulate redox status of cells, the protector and blocker of SH-groups, or N-acetylcysteine were used. Results. Incubation of cultures in the presence of SH-group blocker resulted in the imbalance in the glutathione system with increased concentration of glutathionylated proteins. A decreased redox status led to an increased CD95 and CD120 expression levels on the membrane of P19 tumor cells, as well as to decreased mitochondrial potential and increased intracellular calcium ion concentration, thus contributing to the launch of a P19 tumor cells. The presence of SH-group blocker and N-acetylcysteine resulted in an increased number of annexinpositive cells. Conclusion. Along with the development of oxidative stress, the molecular redox-dependent mechanisms of apoptosis dysregulation through the mitochondrial and receptor-mediated pathways were identified in the P19 tumor cells.

апоптозбелковосвязанный глутатионокислительный стрессопухолевый ростapoptosisglutathionylated proteinoxidative stresstumor growthReferencesОктябрьский О.Н., Смирнова Г.В. Редокс-регуляция клеточных функций. Биохимия. 2007; 72 (2): 158–175.Oktyabr’skiy O.N., Smirnova G.V. Redox regulation of cellular functions. Biokhimiya; 72 (2): 158–174. [in Russian]Степовая Е.А., Рязанцева Н.В., Носарева О.Л., Закирова Е.В., Наумова А.И., Веснина О.Н., Орлов Д.С., Шахристова Е.В., Иванов В.В., Новицкий В.В. Роль окислительной модификации белков в редоксзависимой регуляции апоптоза опухолевых клеток. Молекулярная медицина. 2015; 4: 60–64.Stepovaya E.A., Ryazantseva N.V., Nosareva O.L., Zakirova E.V., Naumova A.I., Vesnina O.N., Orlov D.S., Shakhristova E.V., Ivanov V.V., Novitskiy V.V. The role of oxidative protein modification in redox-dependent regulation of tumor cell apoptosis. Molekulyarnaya meditsina. 2015; 4: 60–64. [in Russian]Kojima S., Nakayama K., Ishida H. Low dose gamma-rays activate immune functions via induction of glutathione and delay tumor growth. J Radiat Res. 2004 Mar; 45 (1): 33–9.Kojima S., Nakayama K., Ishida H. Low dose gamma-rays activate immune functions via induction of glutathione and delay tumor growth. J Radiat Res. 2004 Mar; 45 (1): 33–9.Burchill B.R., Oliver J.M., Pearson C.B., Leinbach E.D., Berlin R.D. Microtubule dynamics and glutathione metabolism in phagocytizing human polymorphonuclear leukocytes. J Cell Biol. 1978; 76 (2): 439–447.Burchill B.R., Oliver J.M., Pearson C.B., Leinbach E.D., Berlin R.D. Microtubule dynamics and glutathione metabolism in phagocytizing human polymorphonuclear leukocytes. J Cell Biol. 1978; 76 (2): 439–447.Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976 May 7; 72: 248–54.Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976 May 7; 72: 248–54.Merritt J.E., Carthy Mc S.A., Davies M.P., Moores K.E. Use of fluo-3 to measure cytosolic Ca2+ in platelets and neutrophils. Loading cells with the dye, calibration of traces, measurements in the presence of plasma, and buffering of cytosolic Ca2+. Biochem J. 1990 Jul 15; 269 (2): 513–9.Merritt J.E., Carthy Mc S.A., Davies M.P., Moores K.E. Use of fluo-3 to measure cytosolic Ca2+ in platelets and neutrophils. Loading cells with the dye, calibration of traces, measurements in the presence of plasma, and buffering of cytosolic Ca2+. Biochem J. 1990 Jul 15; 269 (2): 513–9.Гланц С. Медико-биологическая статистика. М., 1998. 459 с.Glants S. Medicobiological statistics. Moscow, 1998. 459 p. [in Russian]Trachootham D., Lu W., Ogasawara M.A., Nilsa R.D., Huang P. Redox regulation of cell survival. Antioxid Redox Signal. 2008 Aug; 10 (8): 1343–74. doi: 10.1089/ars.2007.1957.Trachootham D., Lu W., Ogasawara M.A., Nilsa R.D., Huang P. Redox regulation of cell survival. Antioxid Redox Signal. 2008 Aug; 10 (8): 1343–74. doi: 10.1089/ars.2007.1957.D’Alessio M., Nicola M. De, Coppola S., Gualandi G., Pugliese L., Cerella C., Cristofanon S., Civitareale P., Ciriolo M.R., Bergamaschi A., Magrini A., Ghibelli L. Oxidative Bax dimerization promotes its translo- cation to mitochondria independently of apoptosis. FASEB J. 2005 Sep; 19 (11): 1504–6.D’Alessio M., Nicola M. De, Coppola S., Gualandi G., Pugliese L., Cerella C., Cristofanon S., Civitareale P., Ciriolo M. R., Bergamaschi A., Magrini A., Ghibelli L. Oxidative Bax dimerization promotes its translocation to mitochondria independently of apoptosis. FASEB J. 2005 Sep; 19 (11): 1504–6.Buzek J., Latonen L., Kurki S., Peltonen K., Laiho M. Redox state of tumor suppressor p53 regulates its sequence-specific DNA binding in DNA-damaged cells by cysteine 277. Nucleic Acids Res. 2002 Jun 1; 30 (11): 2340–8.Buzek J., Latonen L., Kurki S., Peltonen K., Laiho M. Redox state of tumor suppressor p53 regulates its sequence-specific DNA binding in DNA-damaged cells by cysteine 277. Nucleic Acids Res. 2002 Jun 1; 30 (11): 2340–8.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.