oncotomskСибирский онкологический журналSiberian journal of oncology1814-48612312-3168Tomsk National Research Medical Сепtеr of the Russian Academy of Sciences10.21294/1814-4861-2018-17-4-30-35oncotomsk-812Research ArticleЛАБОРАТОРНЫЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯLABORATORY AND EXPERIMENTAL STUDIESУСЛОВИЯ ЭФФЕКТИВНОГО ПОДАВЛЕНИЯ ПЦР С ПОМОЩЬЮ LNA-ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ПРОСТОЙ И ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ ДЕТЕКЦИИ СОМАТИЧЕСКИХ МУТАЦИЙREQUIREMENTS FOR EFFICIENT PCR CLAMPING BY LOCKED NUCLEIC ACID OLIGONUCLEOTIES FOR SIMPLE AND SENSITIVE DETECTION OF SOMATIC MUTATIONSШаманинВ. А.ShamaninV. A.

Россия, 630117, г. Новоcибирск, ул. Тимакова, 2

Россия, 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины

SPIN-код: 5669-0201. AuthorID: 477135

2, Timakova Street, 630117-Novosibirsk, Russia

2, Timakova Street, 630117-Novosibirsk, Russia

PhD, Senior Researcher, Federal Research Center of  Fundamental and Translational Medicine

vladimir.shamanin@gmail.comКарповИ. В.KarpovI. V.

Россия, 630117, г. Новоcибирск, ул. Тимакова, 2

Россия, 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2

лаборант, Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины

2, Timakova Street, 630117-Novosibirsk, Russia

2, Timakova Street, 630117-Novosibirsk, Russia

laboratory assistant, Federal Research Center of Fundamental and Translational Medicine

karp_na@mail.ruПисареваЕ. Е.PisarevaE. E.

Россия, 630117, г. Новоcибирск, ул. Тимакова, 2

кандидат биологических наук, научный сотрудник, Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины

SPIN-код: 7151-5842. AuthorID: 795623

2, Timakova Street, 630117-Novosibirsk, Russia

PhD, Senior Researcher, Federal Research Center of Fundamental and Translational Medicine

katerina.pisareva@mail.ruГуткинаН. И.GutkinaN. I.

Россия, 630117, г. Новоcибирск, ул. Тимакова, 2

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, Федеральный исследовательскийцентр фундаментальной и трансляционной медицины

SPIN-код: 6170-9570. AuthorID: 98026

2, Timakova Street, 630117-Novosibirsk, Russia

PhD, Senior Researcher, Federal Research Center of Fundamental and Translational Medicine

gutkina.nadezhda@gmail.comКоваленкоС. П.KovalenkoS. P.

Россия, 630117, г. Новоcибирск, ул. Тимакова, 2

Россия, 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2

доктор биологических наук, руководитель лаборатории, Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины

SPIN-код: 2272-6747. AuthorID: 92420

2, Timakova Street, 630117-Novosibirsk, Russia

2, Timakova Street, 630117-Novosibirsk, Russia

DSc, Head of Laboratory, Federal Research Center of Fundamental and Translational Medicine

sp_kovalenko@yahoo.comФедеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины» ООО «БиоЛинк»РоссияFederal Research Center of Fundamental and Translational Medicine Biolink LtdRussian FederationФедеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины»РоссияFederal Research Center of Fundamental and Translational MedicineRussian Federation2018010920181743035Copyright © Шаманин В.А., Карпов И.В., Писарева Е.Е., Гуткина Н.И., Коваленко С.П., 20182018Шаманин В.А., Карпов И.В., Писарева Е.Е., Гуткина Н.И., Коваленко С.П.Shamanin V.A., Karpov I.V., Pisareva E.E., Gutkina N.I., Kovalenko S.P.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.siboncoj.ru/jour/article/view/812

Специфическое блокирование амплификации аллеля дикого типа в ПЦР с помощью олигонуклеотидов, модифицированных по остатку рибозы (закрытые нуклеиновые кислоты, locked nucleic acids, LNA), используется для высокочувствительной детекции соматических мутаций в опухолях. Описаны различные версии метода анализа мутаций с использованием LNA-олигонуклеотидов как с дополнительной модификацией фосфотиоатными группами, так и без таких групп, при этом использовались  различные ДНК полимеразы. В работе проведен анализ оптимальных условий для успешного специфического блокирования ПЦР с помощью LNA-олигонуклеотидов при анализе мутаций в генах KRAS и  BRAF. Мы обнаружили, что фосфотиоатная защита на 5’-конце олигонуклеотидов не влияет на эффективность блокирования аллеля дикого типа. Выявлено, что для большинства последовательностей  эффективное блокирование наблюдается при проведении шага отжига и элонгации ПЦР при температуре на  20–25°С ниже температуры плавления LNA-олигонуклеотида. При таких условиях реакции возможна простая и высокочувствительная детекция мутаций в генах KRAS и BRAF с использованием как секвенирования по Сэнгеру, так и ПЦР в реальном времени с Taqman зондами.

PCR clamping/wild-type blocking PCR with non-extendable locked nucleic acid (LNA) oligonucleotides is used for sensitive detection of somatic mutations in tumors. Various  versions of the technique use different DNA polymerases and LNA oligonucleotides with and  without additional phosphorothioate modifications. Here we studied requirements for successful  PCR clamping with LNA oligonucleotides and Taq DNA polymerase for analysis of mutations in  KRAS and BRAF genes by means of real-time PCR and Sanger sequencing. We found that  addition of phosphorothioate linkages at the 5’-end of LNA oligonucleotide to protect from 5’- exonuclease activity of Taq DNA polymerase did not improve clamping. For most target  sequences, efficient clamping was observed at melting temperature of LNA oligonucleotide  20‑25°C above annealing/extension temperature of the PCR with a 2-step protocol. Under such  conditions, simple and sensitive detection of mutations in KRAS and BRAF genes was feasible using real-time PCR with TaqMan probes or Sanger sequencing.

запертая нуклеиновая кислотазажим PCRмутацииKRASBRAFДНК-полимераза Taqlocked nucleic acidPCR clampmutationsKRASBRAFTaq DNA polymerase.ReferencesDominguez P.L., Kolodney M.S. Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene. 2005 Oct 13; 24(45): 6830–4. doi: 10.1038/sj.onc.1208832.Dominguez P.L., Kolodney M.S. Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene. 2005 Oct 13; 24(45): 6830–4. doi: 10.1038/sj.onc.1208832.Sidon P., Heimann P., Lambert F., Dessars B., Robin V., El Housni H. Combined locked nucleic acid and molecular beacon technologies for sensitive detection of the JAK2V617F somatic single-base sequence variant. Clin Chem. 2006; 52(7): 1436– 1438. doi: 10.1373/clinchem.2006.066886.Sidon P., Heimann P., Lambert F., Dessars B., Robin V., El Housni H. Combined locked nucleic acid and molecular beacon technologies for sensitive detection of the JAK2V617F somatic single-base sequence variant. Clin Chem. 2006; 52(7): 1436– 1438. doi: 10.1373/clinchem.2006.066886.Thiede C., Creutzig E., Illmer T., Schaich M., Heise V., Ehninger G., Landt O. Rapid and sensitive typing of NPM1 mutations using LNAmediated PCR clamping. Leukemia. 2006; 20(10): 1897–1899. doi: 10.1038/sj.leu.2404367.Thiede C., Creutzig E., Illmer T., Schaich M., Heise V., Ehninger G., Landt O. Rapid and sensitive typing of NPM1 mutations using LNAmediated PCR clamping. Leukemia. 2006; 20(10): 1897–1899. doi: 10.1038/sj.leu.2404367.Arcila M., Lau C., Nafa K., Ladanyi M. Detection of KRAS and BRAF mutations in colorectal carcinoma roles for high-sensitivity locked nucleic acid-PCR sequencing and broad-spectrum mass spectrometry genotyping. J Mol Diagn. 2011 Jan; 13(1): 64–73. doi: 10.1016/j.jmoldx.2010.11.005.Arcila M., Lau C., Nafa K., Ladanyi M. Detection of KRAS and BRAF mutations in colorectal carcinoma roles for high-sensitivity locked nucleic acid-PCR sequencing and broad-spectrum mass spectrometry genotyping. J Mol Diagn. 2011 Jan; 13(1): 64–73. doi: 10.1016/j.jmoldx.2010.11.005.Koshkin A.A., Singh S.K., Nielsen P., Rajwanshi V.K., Kumar R., Meldgaard M., Wengel J. LNA (Locked Nucleic Acids): Synthesis of the adenine, cytosine, guanine, 5- methylcytosine, thymine and uracil bicyclonucleoside monomers, oligomerisation, and unprecedented nucleic acid recognition. Tetrahedron. 1998; 54(14): 3607–3630.Koshkin A.A., Singh S.K., Nielsen P., Rajwanshi V.K., Kumar R., Meldgaard M., Wengel J. LNA (Locked Nucleic Acids): Synthesis of the adenine, cytosine, guanine, 5- methylcytosine, thymine and uracil bicyclonucleoside monomers, oligomerisation, and unprecedented nucleic acid recognition. Tetrahedron. 1998; 54(14): 3607–3630.You Y., Moreira B.G., Behlke M.A., Owczarzy R. Design of LNA probes that improve mismatch discrimination. Nucleic Acids Res. 2006; 34(8): e60. doi: 10.1093/nar/gkl175.You Y., Moreira B.G., Behlke M.A., Owczarzy R. Design of LNA probes that improve mismatch discrimination. Nucleic Acids Res. 2006; 34(8): e60. doi: 10.1093/nar/gkl175.Owczarzy R., You Y., Groth C.L., Tataurov A.V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 2011; 50(43): 9352–9367. doi: 10.1021/bi200904e.Owczarzy R., You Y., Groth C.L., Tataurov A.V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 2011; 50(43): 9352–9367. doi: 10.1021/bi200904e.Yu D., Mukai M., Liu Q., Steinman C.R. Specific inhibition of PCR by non-extendable oligonucleotides using a 5’ to 3’ exonuclease-deficient DNA polymerase. Biotechniques. 1997; 23(4): 714–716, 718–720.Yu D., Mukai M., Liu Q., Steinman C.R. Specific inhibition of PCR by non-extendable oligonucleotides using a 5’ to 3’ exonuclease-deficient DNA polymerase. Biotechniques. 1997; 23(4): 714–716, 718–720.Laughlin T.S., Becker M.W., Liesveld J.L., Mulford D.A., Abboud C.N., Brown P., Rothberg P.G. Rapid method for detection of mutations in the nucleophosmin gene in acute myeloid leukemia. J Mol Diagn. 2008 Jul; 10(4): 338–45. doi: 10.2353/jmoldx.2008.070175.Laughlin T.S., Becker M.W., Liesveld J.L., Mulford D.A., Abboud C.N., Brown P., Rothberg P.G. Rapid method for detection of mutations in the nucleophosmin gene in acute myeloid leukemia. J Mol Diagn. 2008 Jul; 10(4): 338–45. doi: 10.2353/jmoldx.2008.070175.Laughlin T.S., Moliterno A.R., Stein B.L., Rothberg P.G. Detection of exon 12 Mutations in the JAK2 gene: enhanced analytical sensitivity using clamped PCR and nucleotide sequencing. J Mol Diagn. 2010 May; 12(3): 278–82. doi: 10.2353/jmoldx.2010.090177.Laughlin T.S., Moliterno A.R., Stein B.L., Rothberg P.G. Detection of exon 12 Mutations in the JAK2 gene: enhanced analytical sensitivity using clamped PCR and nucleotide sequencing. J Mol Diagn. 2010 May; 12(3): 278–82. doi: 10.2353/jmoldx.2010.090177.Huang Q., Wang G.Y., Huang J.F., Zhang B., Fu W.L. High sensitive mutation analysis on KRAS gene using LNA/DNA chimeras as PCR amplification blockers of wild-type alleles. Mol Cell Probes. 2010; 24(6): 376–380. doi: 10.1016/j.mcp.2010.07.010.Huang Q., Wang G.Y., Huang J.F., Zhang B., Fu W.L. High sensitive mutation analysis on KRAS gene using LNA/DNA chimeras as PCR amplification blockers of wild-type alleles. Mol Cell Probes. 2010; 24(6): 376–380. doi: 10.1016/j.mcp.2010.07.010.Exiqon [Internet]. URL: https://www.exiqon.com/oligo-tools (cited 25 June 2018).Exiqon [Internet]. URL: https://www.exiqon.com/oligo-tools (cited 25 June 2018).Nafa K., Hameed M., Arcila M.E. Locked Nucleic Acid Probes (LNA) for Enhanced Detection of Low-Level, Clinically Significant Mutations. Methods Mol Biol. 2016; 1392: 71–82. doi: 10.1007/978-1-4939-3360-0_8.Nafa K., Hameed M., Arcila M.E. Locked Nucleic Acid Probes (LNA) for Enhanced Detection of Low-Level, Clinically Significant Mutations. Methods Mol Biol. 2016; 1392: 71–82. doi: 10.1007/978-1-4939-3360-0_8.Pavlov A.R., Pavlova N.V., Kozyavkin S.A., Slesarev A.I. Cooperation between catalytic and DNA binding domains enhances thermostability and supports DNA synthesis at higher temperatures by thermostable DNA polymerases. Biochemistry. 2012 Mar 13; 51(10): 2032–43. doi: 10.1021/bi2014807.Pavlov A.R., Pavlova N.V., Kozyavkin S.A., Slesarev A.I. Cooperation between catalytic and DNA binding domains enhances thermostability and supports DNA synthesis at higher temperatures by thermostable DNA polymerases. Biochemistry. 2012 Mar 13; 51(10): 2032–43. doi: 10.1021/bi2014807.OligoAnalyzer 3.1. [Internet]. URL: http://eu.idtdna.com/calc/analyzer. (cited 25 June 2018).OligoAnalyzer 3.1. [Internet]. URL: http://eu.idtdna.com/calc/analyzer. (cited 25 June 2018).Stadler J., Eder J., Pratscher B., Brandt S., Schneller D., Müllegger R., Vogl C., Trautinger F., Brem G., Burgstaller J.P. SNPase-ARMS qPCR: Ultrasensitive Mutation- Based Detection of Cell-Free Tumor DNA in Melanoma Patients. PLoS One. 2015 Nov 12; 10(11): e0142273. doi: 10.1371/journal.pone.0142273.Stadler J., Eder J., Pratscher B., Brandt S., Schneller D., Müllegger R., Vogl C., Trautinger F., Brem G., Burgstaller J.P. SNPase-ARMS qPCR: Ultrasensitive Mutation- Based Detection of Cell-Free Tumor DNA in Melanoma Patients. PLoS One. 2015 Nov 12; 10(11): e0142273. doi: 10.1371/journal.pone.0142273.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.