oncotomskСибирский онкологический журналSiberian journal of oncology1814-48612312-3168Tomsk National Research Medical Сепtеr of the Russian Academy of Sciences10.21294/1814-4861-2018-17-6-78-83oncotomsk-906Research ArticleЛАБОРАТОРНЫЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯLABORATORY AND EXPERIMENTAL STUDIESКарбонилирование белков как возможный способ модуляции пролиферации клеток аденокарциномы молочной железыProtein carbonylation as a possible way to modulate breast cancer cell proliferationhttps://orcid.org/0000-0003-2938-1137ШахристоваЕ. В.ShakhristovaE. V.

Шахристова Евгения Викторовна - кандидат медицинских наук, доцент кафедры биохимии и молекулярной биологии с курсом клинической лабораторной диагностики.

Томск, 634050, ул. Московский тракт, 2

SPIN-код: 8125-6414, ResearcherID (WOS): F-9564-2015, Author ID (Scopus): 42762264000

Evgeniya V. Shakhristova - MD, PhD, Associate Professor of the Department of Biochemistry and Molecular Biology with the course of clinical laboratory diagnostics.

2, Moskovky tract, 634050-Tomsk

shaxristova@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9339-6304СтеповаяЕ. А.StepovayaE. A.

Степовая Елена Алексеевна - доктор медицинских наук, профессор кафедры биохимии и молекулярной биологии с курсом клинической лабораторной диагностики.

Томск, 634050, ул. Московский тракт, 2

SPIN-код: 5562-4522, ResearcherID (WOS): N-4039-2016, Author ID (Scopus): 6603230755

Elena A. Stepovaya - MD, DSc, Professor of the Department of Biochemistry and Molecular Biology with the course of clinical laboratory diagnostics.

2, Moskovky tract, 634050-Tomsk

ResearcherID: N-4039-2016, Author ID (Scopus): 6603230755

https://orcid.org/0000-0003-4093-4927СадыковаА. А.SadykovaA. A.

Садыкова Анна Алексеевна - кандидат медицинских наук, доцент кафедры биохимии и молекулярной биологии с курсом клинической лабораторной диагностики.

Томск, 634050, ул. Московский тракт, 2

SPIN-код: 1275-9603, ResearcherID (WOS): E-5929-2018

Anna A. Sadykova - MD, PhD, Associate Professor of the Department of Biochemistry and Molecular Biology with the course of clinical laboratory diagnostics.

2, Moskovky tract, 634050-Tomsk

SPIN ID: 1275-9603, Researcher ID (WOS): E-5929-2018

https://orcid.org/0000-0002-9577-8370НовицкийВ. В.NovitskyV. V.

Новицкий Вячеслав Викторович - академик РАН, доктор медицинских наук, профессор кафедры патофизиологии.

Томск, 634050, ул. Московский тракт, 2

SPIN-код: 7160-6881, ResearcherID (WOS): M-8386-2016, Author ID (Scopus): 7004689872

Vaycheslav V. Novitsky - MD, Professor, Member of Russian Academy of Sciences, Department of Pathophysiology.

2, Moskovky tract, 634050-Tomsk

ResearcherID (WOS): M-8386-2016, Author ID (Scopus): 7004689872

ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава РоссииРоссияSiberian State Medical UniversityRussian Federation2018010120191767883Copyright © Шахристова Е.В., Степовая Е.А., Садыкова А.А., Новицкий В.В., 20192019Шахристова Е.В., Степовая Е.А., Садыкова А.А., Новицкий В.В.Shakhristova E.V., Stepovaya E.A., Sadykova A.A., Novitsky V.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.siboncoj.ru/jour/article/view/906Введение

Введение. Нерешенная проблема растущей онкологической заболеваемости и смертности в мире ставит задачу разработки новых методических подходов в понимании молекулярных механизмов опухолевого роста, ассоциированного с дисбалансом редокс-регуляции внутриклеточных систем.

Цель исследования - установить роль карбонилирования редокс-белков в регуляции пролиферации клеток аденокарциномы молочной железы при модуляции редокс-статуса.

Материал и методы

Материал и методы. В интактных клетках аденокарциномы молочной железы и культивируемых при модуляции редокс-статуса с использованием 5 мМ N-этилмалеимида (блокатор SH-групп белков и пептидов) и 5 мМ 1,4-дитиоэритритола (протектор тиоловых групп) определяли содержание тиоредоксина и его карбонилированной формы методом вестерн-блоттинга; активность тиоредоксинредуктазы и концентрацию карбонильных производных белков определяли спектрофотометрическим методом; распределение клеток по фазам клеточного цикла оценивали методом проточной цитофлуориметрии.

Результаты

Результаты. При действии N-этилмалеимида остановка пролиферации опухолевых клеток в S фазе была связана c окислительной модификацией белков, в том числе карбонилированием тиоредоксина. Остановка клеточного цикла в G0/G1 фазах при культивировании клеток линии МСF-7 в присутствии 1,4-дитиоэритритола сопровождалась увеличением содержания восстановленных форм тиоредоксина и глутатиона.

Introduction

Introduction. High rates of cancer incidence and mortality worldwide dictate the necessity of developing new methodological approaches in understanding the molecular mechanisms of cancer progression associated with intracellular redox regulation imbalance.

The objective of the study was to evaluate the role of protein carbonylation in regulating breast cancer cell proliferation under redox status modulation.

Materials and Methods

Materials and Methods. In the intact breast cancer cells and in the cells cultured under redox status modulation using 5mM N-ethylmaleimide (an - SH group blocker) and 5 Mm 1,4-dithioerythritol (a thiol group protector), the concentration of thioredoxin and its carbonylated form was measured using Western blot analysis. The activity of thioredoxin reductase and the level of protein carbonyl derivatives were determined using spectrophotometry. Cell cycle phase distribution was evaluated by flow cytometry.

Results and Discussion

Results and Discussion. Under the effect of N-ethylmaleimide, cell cycle arrest in the S-phase was confirmed by oxidative modification of proteins, including thioredoxin carbonylation. When culturing MCF-7 cells in the presence of 1,4-dithioerythritol, cell cycle arrest in the G0/G1 phases was associated with a rise in the concentrations of reduced thioredoxin and glutathione forms.

Conclusion

Conclusion. The thioredoxin system and oxidative modification of proteins are involved in redox-dependent modulation of breast cancer cell proliferation. Studies in the area of redox proteomics offer great potential to seek molecular targets of malignant transformation of breast cells.

окислительная модификация белковкарбонилированный тиоредоксинаденокарцинома молочной железыпролиферацияокислительный стрессредокс-регуляциявнутриклеточные процессыoxidative modification of proteinscarbonylated thioredoxinbreast denocarcinoma proliferationoxidative stressredox regulationintracellular processesГрант Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых - кандидатов наук (грант № МК-1742.2017.7)Grant of the President of the Russian Federation for the State support of young Russian PhD scientists (project № YC-1742.2017.7)ReferencesЗдравоохранение в России. 2017: Статистический сборник. М.: Росстат; 2017. 170.Healthcare in Russia. 2017: A statistical compilation. Moscow: Rosstat; 2017. 170. (in Russian).Eaton P. Protein thiol oxidation in health and disease: techniques for measuring disulfides and related modifications in complex protein mixtures. Free Radic. Biol. Med. 2006; 40 (11): 1889-99. doi: 10.1016/j. freeradbiomed.2005.12.037.Eaton P. Protein thiol oxidation in health and disease: techniques for measuring disulfides and related modifications in complex protein mixtures. Free Radic. Biol. Med. 2006; 40 (11): 1889-99. doi: 10.1016/j. freeradbiomed.2005.12.037.ButterfieldD.A., Dalle-Donne I. Redox proteomics: from protein modifications to cellular dysfunction and disease. Mass Spectrom. Rev. 2014; 33 (1): 1-6. doi: 10.1002/mas.21404.ButterfieldD.A., Dalle-Donne I. Redox proteomics: from protein modifications to cellular dysfunction and disease. Mass Spectrom. Rev. 2014; 33 (1): 1-6. doi: 10.1002/mas.21404.Clementino M., Shi X., Zhang Z. Oxidative stress in carcinogenesis. Current Opinion in Toxicology. 2018; (7): 116-121. doi: 10.1016/j.cotox.2017.11.014.Clementino M., Shi X., Zhang Z. Oxidative stress in carcinogenesis. Current Opinion in Toxicology. 2018; (7): 116-121. doi: 10.1016/j.cotox.2017.11.014.Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин В.З., Бондарь И.А., Труфакин В.А. Окислительный стресс: Патологические состояния и заболевания. Новосибирск, 2008. 284.MenshchikovaE.B., ZenkovN.K., Lankin V.Z., Bondar I.A., Trufakin VA. Oxidative stress: Pathological conditions and diseases. Novosibirsk, 2008. 284. (in Russian).Brigelius-FloheR., FloheL. Basic principles and emerging concepts in the redox control of transcription factors. Antioxid Redox Signal. 2011; 15 (8): 2335-2381. doi:10.1089/ars.2010.3534.Brigelius-FloheR., FloheL. Basic principles and emerging concepts in the redox control of transcription factors. Antioxid Redox Signal. 2011; 15 (8): 2335-2381. doi:10.1089/ars.2010.3534.Halliwell B. Free radicals and antioxidants: updating a personal view. Nutr. Rev. 2012; 70 (5): 257-265. doi: 10.1111/j.1753-4887.2012.00476.x.Halliwell B. Free radicals and antioxidants: updating a personal view. Nutr. Rev. 2012; 70 (5): 257-265. doi: 10.1111/j.1753-4887.2012.00476.x.Ray P.D., Huang B.W., Tsuji Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling. Cell Signal. 2012; 24 (5): 981-990. doi: 10.1016/J.CELLSIG.2012.01.008.Ray P.D., Huang B.W., Tsuji Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling. Cell Signal. 2012; 24 (5): 981-990. doi: 10.1016/J.CELLSIG.2012.01.008.Зенков Н.К., Кожин П.М., Чечушков А.В., Мартинович Г.Г., Кандалинцева Н.В., Меньщикова Е.Б. Лабиринты регуляции Nrf2. Биохимия. 2017: 82 (5): 749-759.ZenkovN.K., Kozhin PM., Chechush-kov A.V, Martinovich G.G., Kandalintseva N.V, Menshchikova E.B. Labyrinths of regulation Nrf2. Biochemistry. 2017: 82 (5): 749-759. (in Russian).Калинина Е.В., Чернов Н.Н., Саприн А.Н. Участие тио-, перокси- и глутаредоксинов в клеточных редокс-зависимых процессах. Успехи биологической химии. 2008; 48: 319-358.Kalinina E.V, ChernovN.N., SaprinA.N. Participation of thio-, peroxy- and glutaredoxins in redox-dependent cellular processes. Advances in biological chemistry. 2008; 48: 319-358. (in Russian).Harris I.S., Treloar A.E., Inoue S., SasakiM., Gorrini C., Lee K. C., Yung K.Y., Brenner D., Knobbe-Thomsen C.B., Cox MA., Elia A., Berger T., CesconD. W.,AdeoyeA.,BrustleA.,MolyneuxS.D.,MasonJ.M.,Li W.Y., Yamamoto K., WakehamA., BermanH.K., KhokhaR., DoneS.J., Kavanagh T.J., Lam C. W., Mak T. W. Glutathione and thioredoxin antioxidant pathways synergize to drive cancer initiation and progression. Cancer Cell. 2015; 27 (2): 211-22. doi: 10.1016/j.ccell.2014.11.019.Harris I.S., Treloar A.E., Inoue S., SasakiM., Gorrini C., Lee K. C., Yung K.Y., Brenner D., Knobbe-Thomsen C.B., Cox MA., Elia A., Berger T., CesconD. W.,AdeoyeA.,BrustleA.,MolyneuxS.D.,MasonJ.M.,Li W.Y., Yamamoto K., WakehamA., BermanH.K., KhokhaR., DoneS.J., Kavanagh T.J., Lam C. W., Mak T. W. Glutathione and thioredoxin antioxidant pathways synergize to drive cancer initiation and progression. Cancer Cell. 2015; 27 (2): 211-22. doi: 10.1016/j.ccell.2014.11.019.YaoP., ChenX., Yan Y, LiuF, Zhang Y., GuoX., XuB. Glutaredoxin 1, glutaredoxin 2, thioredoxin 1, and thioredoxin peroxidase 3 play important roles in antioxidant defense in Apis cerana cerana. Free Radic Biol Med. 2014 Mar; 68: 335^6. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2013.12.020.YaoP., ChenX., Yan Y, LiuF, Zhang Y., GuoX., XuB. Glutaredoxin 1, glutaredoxin 2, thioredoxin 1, and thioredoxin peroxidase 3 play important roles in antioxidant defense in Apis cerana cerana. Free Radic Biol Med. 2014 Mar; 68: 335^6. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2013.12.020.Sahaf B., Heydari K., Herzenberg LA. Lymphocyte surface thiol levels. Proc Natl Acad Sci USA. 2003; 100 (7): 4001-05.Sahaf B., Heydari K., Herzenberg LA. Lymphocyte surface thiol levels. Proc Natl Acad Sci USA. 2003; 100 (7): 4001-05.Brunelli L., Crow J.P., Beckman J.S. The comparative toxicity of nitric oxide and peroxynitrite to Escherichia coli. Arch Biochem Biophys. 1995 Jan 10; 316 (1): 327-34.Brunelli L., Crow J.P., Beckman J.S. The comparative toxicity of nitric oxide and peroxynitrite to Escherichia coli. Arch Biochem Biophys. 1995 Jan 10; 316 (1): 327-34.ШахристоваЕ.В., СтеповаяЕА., РудиковЕ.В., НовицкийВ.В.; Сибирский государственный медицинский университет. Способ определения окислительной модификации тиоредоксина. Патент № 2651765 Российская Федерация: МПК G01N 33/53. № 2017118698/15; Заявл. 29.05.2017; Опубл. 23.04.2018, Бюл. № 12.Shakhristova E.V, Stepovaya E.A., Rudikov E.V, Novitsky V.V; Siberian State Medical University. The method for determining the oxidative modification of thioredoxin. Patent No. 2651765 Russian Federation: IPC G01N 33/53. № 2017118698/15; Claims 05.29.2017; Publ. 04.23.2018 Byul. No 12. (in Russian).Tamura T., Stadtman T.C. A new selenoprotein from human lung adenocarcinoma cells: рurification, properties, and thioredoxin reductase activity. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 Feb 6; 93 (3): 1006-11.Tamura T., Stadtman T.C. A new selenoprotein from human lung adenocarcinoma cells: рurification, properties, and thioredoxin reductase activity. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 Feb 6; 93 (3): 1006-11.Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976 May 7; 72: 248-54.Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976 May 7; 72: 248-54.Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты организма. СПб., 2000. 103.Arutunyan A.V, Dubinina E.E., Zybina N.N. Methods for evaluating free radical oxidation and antioxidant protection of the body. Saint-Peterburg, 2000. 103. (in Russian).Murphy M.P., Holmgren A., Larsson N.G., Halliwell B., Chang CJ., Kalyanaraman B., Rhee S.G., Thornalley P.J., Partridge L., Gems D., Nystrom T., Belousov V, Schumacker P.T., Winterbourn C.C. Unraveling the biological roles of reactive oxygen species. Cell Metab. 2011; 13 (4): 361-366. doi: 10.1016/j.cmet.2011.03.010.Murphy M.P., Holmgren A., Larsson N.G., Halliwell B., Chang CJ., Kalyanaraman B., Rhee S.G., Thornalley P.J., Partridge L., Gems D., Nystrom T., Belousov V, Schumacker P.T., Winterbourn C.C. Unraveling the biological roles of reactive oxygen species. Cell Metab. 2011; 13 (4): 361-366. doi: 10.1016/j.cmet.2011.03.010.ШахристоваЕ.В., Степовая ЕА., Рязанцева Н.В.,Носарева О.Л., Якушина В.Д., Иванов В.В., Новицкий В.В. Роль редокс-потенциала системы глутатиона в дисрегуляции апоптоза клеток аденокарциномы молочной железы линии MCF-7. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2015; 160 (9): 351-354.Shakhristova E.V, Stepovaya EA., RyazantsevaN.V, Nosareva O.L., Yakushina VD., Ivanov V.V, Novitsky V.V. The role of the redox potential of the glutathione system in the dysregulation of apoptosis of MCF-7 breast adenocarcinoma cells. Bulletin of experimental biology and medicine. 2015; 160 (9): 351-354. (in Russian).Степовая ЕА., Шахристова Е.В., Рязанцева Н.В., Носаре-ва О.Л., Чильчигашев Р.И., Егорова М.Ю. Система тиоредоксина в регуляции пролиферации клеток линии MCF-7 при модуляции редокс-статуса. Сибирский онкологический журнал. 2016; 15 (4): 50-55. doi: 10.21294/1814-4861-2016-15-4-50-55.Stepovaya EA., Shakhristova E.V, Ryazantseva N.V, Nosareva O.L., Chil’chigashev R.I., Egorova M.Y. The thioredoxin system in regulating MCF-7 cell proliferation under redox status modulation. Siberian journal of oncology. 2016; 15 (4): 50-55. (in Russian). doi: 10.21294/1814-4861-2016-15-4-50-55.Wong C.M., Bansal G., Marcocci L., Suzuki YJ. Proposed role of primary protein carbonylation in cell signaling. Redox Rep. 2012; 17 (2): 90-94. doi: 10.1179/1351000212Y.0000000007.Wong C.M., Bansal G., Marcocci L., Suzuki YJ. Proposed role of primary protein carbonylation in cell signaling. Redox Rep. 2012; 17 (2): 90-94. doi: 10.1179/1351000212Y.0000000007.Burch PM., Heintz N.H. Redox regulation of cell-cycle re-entry: cyclin D1 as a primary target for the mitogenic effects of reactive oxygen and nitrogen species. Antioxid Redox Signal. 2005; 7 (5-6): 741-751. doi: 10.1089/ars.2005.7.741.Burch PM., Heintz N.H. Redox regulation of cell-cycle re-entry: cyclin D1 as a primary target for the mitogenic effects of reactive oxygen and nitrogen species. Antioxid Redox Signal. 2005; 7 (5-6): 741-751. doi: 10.1089/ars.2005.7.741.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.