РОЛЬ ЭПИТЕЛИАЛЬНО-МЕЗЕНХИМАЛЬНОГО ПЕРЕХОДА И АУТОФАГИИ В ПРОТИВООПУХОЛЕВОМ ОТВЕТЕ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ МЕЛАНОМЫ НА ТАРГЕТНОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ MEK и mTOR КИНАЗ

Введение. Возникновение резистентности и дальнейшая опухолевая прогрессия остаются актуальной проблемой в лечении меланомы кожи. Процесс аутофагии и эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) тесно связаны между собой и играют ключевую роль в опухолевой прогрессии. Таргетное коингибирование МЕК и mTOR киназ является потенциальной мишенью для терапии меланомы, нацеленной на блокирование ЭМП.

Цель работы – изучение влияния ко-ингибирования МЕК и mTOR киназ на выживаемость, возможность формирования 3D-сфероидов и миграционные способности клеточных линий меланомы, а также взаимосвязь этих изменений с маркерами ЭМП и аутофагии.

Материал и методы. Работа проведена на клеточных линиях меланомы Mel Z и Mel MTP, полученных от пациентов, проходивших лечение в НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина. Оценку антипролиферативной активности биниметиниба и/или рапамицина исследовали МТТ-тестом. 3D-сфероиды получали на основе RGDпептидов, миграционную способность и инвазивность оценивали к камере Бойдена и базальном матриксе. Изменения экспрессии маркеров аутофагии и ЭМП исследованы иммуноцитохимически или иммуноблоттингом.

Результаты. Рапамицин усиливал цитотоксичность биниметиниба как в 2D-, так и в 3D-культурах клеточных линий меланомы. При этом биниметиниб и рапамицин снижали инвазию, но не миграцию клеток меланомы in vitro. Эффективность комбинации связана со снижением маркеров ЭМП N-кадхерина и β-катенина и аутофагии в клетках меланомы – Беклин 1, р62/SQST M1 и LC3BII .

Заключение. Инактивация аутофагии и ЭМП позволяет преодолевать резистентность к существующей терапии и может быть рассмотрена как перспективная мишень для терапии меланомы.

1. Yang X., Yu D.D., Yan F., Jing Y.Y., Han Z.P., Sun K., Liang L., Hou J., Wei L.X. The role of autophagy induced by tumor microenvironment in different cells and stages of cancer. Cell Biosci. 2015 Mar 28; 5: 14. doi: 10.1186/s13578-015-0005-2.

2. Gugnoni M., Sancisi V., Manzotti G., Gandolfi G., Ciarrocchi A. Autophagy and epithelial-mesenchymal transition: an intricate interplay in cancer. Cell Death Dis. 2016 Dec 8; 7(12): e2520. doi: 10.1038/cddis.2016.415.

3. Kalluri R., Weinberg R.A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 2009 Jun; 119(6): 1420–8. doi: 10.1172/JCI39104.

4. Alonso S.R., Tracey L., Ortiz P., Pérez-Gómez B., Palacios J., Pollán M., Linares J., Serrano S., Sáez-Castillo A.I., Sánchez L., Pajares R., Sánchez-Aguilera A., Artiga M.J., Piris M.A., Rodríguez-Peralto J.L. A High-Throughput Study in Melanoma Identifies Epithelial-Mesenchymal Transition as a Major Determinant of Metastasis. Cancer Res. 2007 Apr 1; 67(7): 3450–60. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-06-3481.

5. Caramel J., Papadogeorgakis E., Hill L., Browne G.J., Richard G., Wierinckx A., Saldanha G., Osborne J., Hutchinson P., Tse G., Lachuer J., Puisieux A., Pringle J.H., Ansieau S., Tulchinsky E. A switch in the expression of embryonic EMT-inducers drives the development of malignant melanoma. Cancer Cell. 2013 Oct 14; 24(4): 466–80. doi: 10.1016/j.ccr.2013.08.018.

6. Sullivan R.J., Fisher D.E. Understanding the Biology of Melanoma and Therapeutic Implications. Hematol Oncol Clin North Am. 2014 Jun; 28(3): 437–53. doi: 10.1016/j.hoc.2014.02.007.

7. van’t Veer L.J., Burgering B.M., Versteeg R., Boot A.J., Ruiter D.J., Osanto S., Schrier P.I., Bos J.L. N-ras mutations in human cutaneous melanoma from sun-exposed body sites. Mol Cell Biol. 1989 Jul; 9(7): 3114–6.

8. Platz A., Egyhazi S., Ringborg U., Hansson J. Human cutaneous melanoma; a review of NRAS and BRAF mutation frequencies in relation to histogenetic subclass and body site. Mol Oncol. 2008 Apr; 1(4): 395–405. doi: 10.1016/j.molonc.2007.12.003.

9. Lin K., Baritaki S., Militello L., Malaponte G., Bevelacqua Y., Bonavida B. The Role of B-RAF Mutations in Melanoma and the Induction of EMT via Dysregulation of the NF-κB/Snail/RKIP/PTEN Circuit. Genes Cancer. 2010 May; 1(5): 409–420. doi: 10.1177/1947601910373795.

10. Whipple C.A., Brinckerhoff C.E. BRAF(V600E) melanoma cells secrete factors that activate stromal fibroblasts and enhance tumourigenicity. Br J Cancer. 2014 Oct 14; 111(8): 1625–33. doi: 10.1038/bjc.2014.452.

11. Salama A.K., Kim K.B. Trametinib (GSK1120212) in the treatment of melanoma. Expert Opin Pharmacother. 2013 Apr; 14(5): 619–27. doi: 10.1517/14656566.2013.770475.

12. Ferguson J., Arozarena I., Ehrhardt M., Wellbrock C. Combination of MEK and SRC inhibition suppresses melanoma cell growth and invasion. Oncogene. 2013 Jan 3; 32(1): 86–96. doi: 10.1038/onc.2012.25.

13. Fenouille N., Tichet M., Dufies M., Pottier A., Mogha A., Soo J.K., Rocchi S., Mallavialle A., Galibert M.-D., Khammari A., Lacour J.-P., Ballotti R., Deckert M., Tartare-Deckert S. The Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT) Regulatory Factor SLUG (SNAI2) Is a Downstream Target of SPARC and AKT in Promoting Melanoma Cell Invasion. PLoS One. 2012; 7(7): e40378. doi: 10.1371/journal.pone.0040378.

14. Thiery J.P., Sleeman J.P. Complex networks orchestrate epithelial– mesenchymal transitions. Nat Rev Mol Cell Biol. 2006 Feb; 7(2): 131–42. doi: 10.1038/nrm1835.

15. Nathanson K.L., Martin A.M., Wubbenhorst B., Greshock J., Letrero R., D’Andrea K., O’Day S., Infante J.R., Falchook G.S., Arkenau H.T., Millward M., Brown M.P., Pavlick A., Davies M.A., Ma B., Gagnon R., Curtis M., Lebowitz P.F., Kefford R., Long G.V. Tumor genetic analyses of patients with metastatic melanoma treated with the BRAF inhibitor dabrafenib (GSK2118436). Clin Cancer Res. 2013 Sep 1; 19(17): 4868–78. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-13-0827.

16. Mikhaylova I.N., Kovalevsky D.A., Morozova L.F., Golubeva V.A., Cheremushkin E.A., Lukashina M.I., Voronina E.S., Burova O.S., Utyashev I.A., Kiselev S.L., Demidov L. V., Beabealashvilli R.S., Baryshnikov A.Y. Cancer/testis genes expression in human melanoma cell lines. Melanoma Res. 2008 Oct; 18(5): 303–13. doi: 10.1097/CMR.0b013e32830e391d.

17. Akasov R., Zaytseva-Zotova D., Burov S., Leko M., Dontenwill M., Chiper M., Vandamme T., Markvicheva E. Formation of multicellular tumor spheroids induced by cyclic RGD-peptides and use for anticancer drug testing in vitro. Int J Pharm. 2016 Jun 15; 506(1–2): 148–57. doi: 10.1016/j.ijpharm.2016.04.005.

18. Ryabaya O., Prokofieva A., Khochenkov D., Abramov I., Zasedatelev A., Stepanova E. Inhibition of endoplasmic reticulum stress-induced autophagy sensitizes melanoma cells to temozolomide treatment. Oncol Rep. 2018 Jul; 40(1): 385–394. doi: 10.3892/or.2018.6430.

19. Chou T.C., Talalay P. Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv. Enzyme Regul. 1984; 22: 27–55.

20. Calero R., Morchon E., Martinez-Argudo I., Serrano R. Synergistic anti-tumor effect of 17AAG with the PI3K/mTOR inhibitor NVP-BEZ235 on human melanoma. Cancer Lett. 2017 Oct 10; 406: 1–11. doi: 10.1016/j.canlet.2017.07.021.

21. Carlino M.S., Todd J.R., Gowrishankar K., Mijatov B., Pupo G.M., Fung C., Snoyman S., Hersey P., Long G. V., Kefford R.F., Rizos H. Differential activity of MEK and ERK inhibitors in BRAF inhibitor resistant melanoma. Mol Oncol. 2014 May; 8(3): 544–54. doi: 10.1016/j.molonc.2014.01.003.

22. Schlegel N.C., von Planta A., Widmer D.S., Dummer R., Christofori G. PI3K signalling is required for a TGFβ-induced epithelial-mesenchymallike transition (EMT-like) in human melanoma cells. Exp Dermatol. 2015 Jan; 24(1): 22–8. doi: 10.1111/exd.12580.

23. Haagensen E.J., Kyle S., Beale G.S., Maxwell R.J., Newell D.R. The synergistic interaction of MEK and PI3K inhibitors is modulated by mTOR inhibition. Br J Cancer. 2012 Apr 10; 106(8): 1386–94. doi: 10.1038/bjc.2012.70.

24. Wang X., Chen K., Yu Y., Xiang Y., Kim J.H., Gong W., Huang J., Shi G., Li Q., Zhou M., Sayers T., Tewary P., Gao B., Wang J.M. Metformin sensitizes lung cancer cells to treatment by the tyrosine kinase inhibitor erlotinib. Oncotarget. 2017 Nov 21; 8(65): 109068–109078. doi: 10.18632/oncotarget.22596.

25. Betz C., Hall M.N. Where is mTOR and what is it doing there? J Cell Biol. 2013 Nov 25; 203(4): 563–74. doi: 10.1083/jcb.201306041.

26. Vultur A., Villanueva J., Krepler C., Rajan G., Chen Q., Xiao M., Li L., Gimotty P.A., Wilson M., Hayden J., Keeney F., Nathanson K.L., Herlyn M. MEK inhibition affects STAT3 signaling and invasion in human melanoma cell lines. Oncogene. 2014 Apr 3; 33(14): 1850–61. doi: 10.1038/onc.2013.131.

27. Solit D.B., Garraway L.A., Pratilas C.A., Sawai A., Getz G., Basso A., Ye Q., Lobo J.M., She Y., Osman I., Golub T.R., Sebolt-Leopold J., Sellers W.R., Rosen N. BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition. Nature. 2006 Jan 19; 439(7074): 358–62. doi: 10.1038/nature04304.

28. Gilmartin A.G., Bleam M.R., Groy A., Moss K.G., Minthorn E.A., Kulkarni S.G., Rominger C.M., Erskine S., Fisher K.E., Yang J., Zappacosta F., Annan R., Sutton D., Laquerre S.G. Is an Inhibitor of MEK Activity and Activation with Favorable Pharmacokinetic Properties for Sustained In Vivo Pathway Inhibition. Clin Cancer Res. 2011 Mar 1; 17(5): 989–1000. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-10-2200.

29. Vu H.L., Rosenbaum S., Capparelli C., Purwin T.J., Davies M.A., Berger A.C., Aplin A.E. MIG6 Is MEK Regulated and Affects EGF-Induced Migration in Mutant NRAS Melanoma. J Invest Dermatol. 2016 Feb; 136(2): 453–463. doi: 10.1016/j.jid.2015.11.012.

30. Leight J.L., Tokuda E.Y., Jones C.E., Lin A.J., Anseth K.S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Apr 28; 112(17): 5366–71. doi: 10.1073/pnas.1505662112.

31. Ge X., Fu Y.M., Meadows G.G. U0126, a mitogen-activated protein kinase kinase inhibitor, inhibits the invasion of human A375 melanoma cells. Cancer Lett. 2002; 179(2): 133–140.

32. Qiang L., He Y.-Y. Autophagy deficiency stabilizes TWIST1 to promote epithelial-mesenchymal transition. Autophagy. 2014 Oct 1; 10(10): 1864–5. doi: 10.4161/auto.32171.

33. Shen H., Yin L., Deng G., Guo C., Han Y., Li Y., Cai C., Fu Y., Liu S., Zeng S. Knockdown of Beclin-1 impairs epithelial-mesenchymal transition of colon cancer cells. J Cell Biochem. 2018 Aug; 119(8): 7022–7031. doi: 10.1002/jcb.26912.

34. Nitta T., Sato Y., Ren X.S., Harada K., Sasaki M., Hirano S., Nakanuma Y. Autophagy may promote carcinoma cell invasion and correlate with poor prognosis in cholangiocarcinoma. Int J Clin Exp Pathol. 2014 Jul 15; 7(8): 4913–21.

35. Chen Y., Lu Y., Lu C., Zhang L. Beclin-1 expression is a predictor of clinical outcome in patients with esophageal squamous cell carcinoma and correlated to hypoxia-inducible factor (HIF)-1alpha expression. Pathol Oncol Res. 2009 Sep; 15(3): 487–93. doi: 10.1007/s12253-008-9143-8.

36. Ko Y.H., Cho Y.-S., Won H.S., Jeon E.K., An H.J., Hong S.U., Park J.H., Lee M.A. Prognostic significance of autophagy-related protein expression in resected pancreatic ductal adenocarcinoma. Pancreas. 2013 Jul; 42(5): 829–35. doi: 10.1097/MPA.0b013e318279d0dc.

37. Masuda G.O., Yashiro M., Kitayama K., Miki Y., Kasashima H., Kinoshita H., Morisaki T., Fukuoka T., Hasegawa T., Sakurai K., Toyokawa T., Kubo N., Tanaka H., Muguruma K., Masaichi O., Hirakawa K. Clinicopathological Correlations of Autophagy-related Proteins LC3, Beclin 1 and p62 in Gastric Cancer. Anticancer Res. 2016; 36(1): 129–136.