ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ЭНЗАСТАУРИНА – НОВЫЙ АСПЕКТ В МЕХАНИЗМЕ ДЕЙСТВИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ПРЕПАРАТА ИЗ ГРУППЫ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕИНКИНАЗ

Цель исследования – провести анализ способности 5 противоопухолевых препаратов из фармакологической группы ингибиторов протеинкиназ (гефитиниб, иматиниб, пазопаниб, понатиниб и энзастаурин) реактивировать экспрессию эпигенетически репрессированного гена GFP в клетках HeLa TI, а также изучить влияние препаратов, обладающих реактивирующим эффектом, на: 1) ацетилирование и метилирование гистонов Н3 и Н4; 2) интегральное метилирование ДНК; 3) активность ферментов HAT и HDAC1; 4) уровень экспрессии генов, кодирующих ферменты эпигенетической регуляции (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B; SIRT1, HDAC1; SETD1A, SETD1B, SUV420H1, SUV420H2, SUV39H1, SUV39H2).
Материал и методы. Скрининг эпигенетической активности противоопухолевых препаратов осуществляли с помощью тест-системы HeLa TI – популяции клеток HeLa с интегрированным ретровирусным вектором, содержащим эпигенетически репрессированный ген GFP. Изменение уровня интегрального метилирования ДНК анализировали с помощью метил-чувствительного рестрикционного анализа MspI/ HpaII. Изменение уровня гистоновых модификаций анализировали методом Вестерн-блоттинг с антителами к ацетилированным и метилированным сайтам гистонов Н3 и Н4. Анализ тотальной активности ферментов семейства НАТ проводили при использовании набора реактивов для определения активности гистоновых ацетилтрансфераз. Анализ экспрессии генов эпигенетических регуляторных ферментов осуществляли с помощью метода количественной ОТ-ПЦР в реальном времени.
Результаты. Показано, что среди исследуемых препаратов способностью реактивировать экспрессию эпигенетически репрессированного гена GFP в популяции HeLa TI обладает только ингибитор протеинкиназы Сβ энзастаурин. Мы продемонстрировали, что при действии энзастаурина происходит снижение уровня интегрального метилирования ДНК и экспрессии генов ДНК-метилтрансфераз DNMT3A и DNMT3B. Также установлено, что энзастаурин снижает уровень экспрессии гистоновых деацетилаз HDAC1 и SIRT1, но не влияет на активность и уровни экспрессии гистоновых ацетилаз, уровень метилирования гистонов (H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3, H4K20me3) и уровень экспрессии гистоновых метилтрансфераз (SUV39H1, SUV39H2, SUV420H1, SUV420H2, SETD1A и SETD1B).
Заключение. Полученные данные важны в плане уточнения механизмов действия 5 противоопухолевых препаратов группы ингибиторов протеинкиназ, в особенности в отношении ингибитора протеинкиназы Cβ энзастаурина, для которого была продемонстрирована способность реактивировать экспрессию эпигенетически молчащих генов за счет влияния на механизмы метилирования ДНК и ацетилирования гистонов.

ингибиторы протеинкиназ, энзастаурин, эпигенетическая активность, HeLa TI, гистоновые модификации, метилирование ДНК, HAT, HDAC

1. Cheng Y., He C., Wang M., Ma X., Mo F., Yang S., Han J., Wei X. Targeting epigenetic regulators for cancer therapy: mechanisms and advances in clinical trials. Signal Transduct Target Ther. 2019 Dec 17; 4: 62. doi: 10.1038/s41392-019-0095-0.

2. Ravegnini G., Sammarini G., Hrelia P., Angelini S. Key Genetic and Epigenetic Mechanisms in Chemical Carcinogenesis. Toxicol Sci. 2015 Nov; 148(1): 2–13. doi: 10.1093/toxsci/kfv165.

3. Han M., Jia L., Lv W., Wang L., Cui W. Epigenetic Enzyme Mutations: Role in Tumorigenesis and Molecular Inhibitors. Front Oncol. 2019 Mar 29; 9: 194. doi: 10.3389/fonc.2019.00194.

4. Gnyszka A., Jastrzebski Z., Flis S. DNA methyltransferase inhibitors and their emerging role in epigenetic therapy of cancer. Anticancer Res. 2013 Aug; 33(8): 2989–96.

5. Li Y., Seto E. HDACs and HDAC Inhibitors in Cancer Development and Therapy. Cold Spring Harb Perspect Med. 2016 Oct 3; 6(10): a026831. doi: 10.1101/cshperspect.a026831.

6. McClure J.J., Li X., Chou C.J. Advances and Challenges of HDAC Inhibitors in Cancer Therapeutics. Advances in Cancer Research. Academic Press. 2018. 183–211 p.

7. Zagni C., Chiacchio U., Rescifina A. Histone methyltransferase inhibitors: novel epigenetic agents for cancer treatment. Curr Med Chem. 2013; 20(2): 167–85. doi: 10.2174/092986713804806667.

8. Italiano A., Soria J.C., Toulmonde M., Michot J.M., Lucchesi C., Varga A., Coindre J.M., Blakemore S.J., Clawson A., Suttle B., McDonald A.A., Woodruff M., Ribich S., Hedrick E., Keilhack H., Thomson B., Owa T., Copeland R.A., Ho P.T.C., Ribrag V. Tazemetostat, an EZH2 inhibitor, in relapsed or refractory B-cell non-Hodgkin lymphoma and advanced solid tumours: a first-in-human, open-label, phase 1 study. Lancet Oncol. 2018 May; 19(5): 649–659. doi: 10.1016/S1470-2045(18)30145-1.

9. Verma N., Rai A.K., Kaushik V., Brünnert D., Chahar K.R., Pandey J., Goyal P. Identification of gefitinib off-targets using a structure-based systems biology approach; their validation with reverse docking and retrospective data mining. Sci Rep. 2016 Sep 22; 6: 33949. doi: 10.1038/srep33949.

10. Ratovitski E.A. Anticancer Natural Compounds as Epigenetic Modulators of Gene Expression. Curr Genomics. 2017 Apr; 18(2): 175–205. doi: 10.2174/1389202917666160803165229.

11. Chung F.F., Herceg Z. The Promises and Challenges of Toxico- Epigenomics: Environmental Chemicals and Their Impacts on the Epigenome. Environ Health Perspect. 2020 Jan; 128(1): 15001. doi: 10.1289/EHP6104.

12. Katz R.A., Jack-Scott E., Narezkina A., Palagin I., Boimel P., Kulkosky J., Nicolas E., Greger J.G., Skalka A.M. High-frequency epigenetic repression and silencing of retroviruses can be antagonized by histone deacetylase inhibitors and transcriptional activators, but uniform reactivation in cell clones is restricted by additional mechanisms. J Virol. 2007 Mar; 81(6): 2592604. doi: 10.1128/JVI.01643-06.

13. Poleshko A., Einarson M.B., Shalginskikh N., Zhang R., Adams P.D., Skalka A.M., Katz R.A. Identification of a functional network of human epigenetic silencing factors. J Biol Chem. 2010 Jan 1; 285(1): 422–33. doi: 10.1074/jbc.M109.064667.

14. Shalginskikh N., Poleshko A., Skalka A.M., Katz R.A. Retroviral DNA methylation and epigenetic repression are mediated by the antiviral host protein Daxx. J Virol. 2013 Feb; 87(4): 2137–50. doi: 10.1128/JVI.02026-12.

15. Varley K.E., Gertz J., Bowling K.M., Parker S.L., Reddy T.E., Pauli-Behn F., Cross M.K., Williams B.A., Stamatoyannopoulos J.A., Crawford G.E., Absher D.M., Wold B.J., Myers R.M. Dynamic DNA methylation across diverse human cell lines and tissues. Genome Res. 2013 Mar; 23(3): 555–67. doi: 10.1101/gr.147942.112.

16. Huang Y., Song H., Hu H., Cui L., You C., Huang L. Trichosanthin inhibits DNA methyltransferase and restores methylation-silenced gene expression in human cervical cancer cells. Mol Med Rep. 2012 Oct; 6(4): 872–8. doi: 10.3892/mmr.2012.994.

17. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 1983 Dec 16; 65(1–2): 55–63. doi: 10.1016/0022-1759(83)90303-4.

18. Shechter D., Dormann H.L., Allis C.D., Hake S.B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2007; 2(6): 1445–57. doi: 10.1038/nprot.2007.202.

19. Li R., Hebert J.D., Lee T.A., Xing H., Boussommier-Calleja A., Hynes R.O., Lauffenburger D.A., Kamm R.D. Macrophage-Secreted TNFα and TGFβ1 Influence Migration Speed and Persistence of Cancer Cells in 3D Tissue Culture via Independent Pathways. Cancer Res. 2017 Jan 15; 77(2): 279–290. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-16-0442.

20. Bhullar K.S., Lagarón N.O., McGowan E.M., Parmar I., Jha A., Hubbard B.P., Rupasinghe H.P.V. Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions. Mol Cancer. 2018; 17(1): 48. doi: 10.1186/s12943-018-0804-2.

21. Kannaiyan R., Mahadevan D. A comprehensive review of protein kinase inhibitors for cancer therapy. Expert Rev Anticancer Ther. 2018 Dec; 18(12): 1249–1270. doi: 10.1080/14737140.2018.1527688.

22. Huang W.S., Metcalf C.A., Sundaramoorthi R., Wang Y., Zou D., Thomas R.M., Zhu X., Cai L., Wen D., Liu S., Romero J., Qi J., Chen I., Banda G., Lentini S.P., Das S., Xu Q., Keats J., Wang F., Wardwell S., Ning Y., Snodgrass J.T., Broudy M.I., Russian K., Zhou T., Commodore L., Narasimhan N.I., Mohemmad Q.K., Iuliucci J., Rivera V.M., Dalgarno D.C., Sawyer T.K., Clackson T., Shakespeare W.C. Discovery of 3-[2-(imidazo[1,2-b]pyridazin-3-yl)ethynyl]-4-methyl-N-{4-[(4-methylpiperazin-1-yl)methyl]-3-(trifluoromethyl)phenyl}benzamide (AP24534), a potent, orally active pan-inhibitor of breakpoint cluster region-abelson (BCR-ABL) kinase including the T315I gatekeeper mutant. J Med Chem. 2010 Jun 24; 53(12): 4701–19. doi: 10.1021/jm100395q.

23. O’Hare T., Shakespeare W.C., Zhu X., Eide C.A., Rivera V.M., Wang F., Adrian L.T., Zhou T., Huang W.S., Xu Q., Metcalf C.A., Tyner J.W., Loriaux M.M., Corbin A.S., Wardwell S., Ning Y., Keats J.A., Wang Y., Sundaramoorthi R., Thomas M., Zhou D., Snodgrass J., Commodore L., Sawyer T.K., Dalgarno D.C., Deininger M.W., Druker B.J., Clackson T. AP24534, a pan-BCR-ABL inhibitor for chronic myeloid leukemia, potently inhibits the T315I mutant and overcomes mutation-based resistance. Cancer Cell. 2009 Nov 6; 16(5): 401–12. doi: 10.1016/j.ccr.2009.09.028.

24. Nowakowski G.S., Zhu J., Zhang Q., Brody J., Sun X., Maly J., Song Y., Rizvi S., Song Y., Lansigan F., Jing H., Cao J., Lue J.K., Luo W., Zhang L., Li L., Han I., Sun J., Jivani M., Liu Y., Heineman T., Smith S.D. ENGINE: a Phase III randomized placebo controlled study of enzastaurin/R-CHOP as frontline therapy in high-risk diffuse large B-cell lymphoma patients with the genomic biomarker DGM1. Future Oncol. 2020 May; 16(15): 991–9. doi: 10.2217/fon-2020-0176.

25. Wilting R.H., Dannenberg J.H. Epigenetic mechanisms in tumorigenesis, tumor cell heterogeneity and drug resistance. Drug Resist Updat. 2012; 15(1–2): 21–38. doi: 10.1016/j.drup.2012.01.008.

26. Delcuve G.P., Khan D.H., Davie J.R. Roles of histone deacetylases in epigenetic regulation: emerging paradigms from studies with inhibitors. Clin Epigenetics. 2012 Mar 12; 4(1): 5. doi: 10.1186/1868-7083-4-5.

27. Rifaï K., Judes G., Idrissou M., Daures M., Bignon Y.J., Penault- Llorca F., Bernard-Gallon D. SIRT1-dependent epigenetic regulation of H3 and H4 histone acetylation in human breast cancer. Oncotarget. 2018 Jul 17; 9(55): 30661–30678. doi: 10.18632/oncotarget.25771.

28. Volkel P., Angrand P.O. The control of histone lysine methylation in epigenetic regulation. Biochimie. 2007; 89(1): 1–20. doi: 10.1016/j.biochi.2006.07.009.

29. Koch A., Joosten S.C., Feng Z., de Ruijter T.C., Draht M.X., Melotte V., Smits K.M., Veeck J., Herman J.G., Van Neste L., Van Criekinge W., De Meyer T., van Engeland M. Analysis of DNA methylation in cancer: location revisited. Nat Rev Clin Oncol. 2018; 15(7): 459–466. doi: 10.1038/s41571-018-0004-4.

30. Patnaik S., Anupriya. Drugs Targeting Epigenetic Modifications and Plausible Therapeutic Strategies Against Colorectal Cancer. Front Pharmacol. 2019; 10: 588. doi: 10.3389/fphar.2019.00588.