Разработка лабораторных моделей in vitro иммунного микроокружения опухоли для оценки параметров качества и специфической эффективности дендритно-клеточной вакцины

Цель исследования ‒ разработка in vitro лабораторных моделей для оценки параметров качества и специфической эффективности дендритно-клеточной вакцины (ДКВ).

Материал и методы. В исследование включены биологические образцы больных злокачественными новообразованиями, получавших вакцинотерапию на основе аутологичных дендритных клеток (ДК). Для индукции пролиферации антигенспецифических Т-лимфоцитов (n=227) использовали незрелые ДК (n=46) и зрелые ДК (n=56). Для изучения противоопухолевой цитотоксической активности in vitro генерированных ЦТЛ (n=18) использовали аутологичные опухолевые клетки меланомы кожи (n=10) или сарком (n=8) пациентов в аналитической системе xCELLigence®. Секрецию цитокинов и цитолитических белков изучали методом мультиплексного анализа, субпопуляционный состав эффекторных Т-лимфоцитов определяли методом проточной цитометрии.

Результаты. В работе показано, что зрелые ДК (CD83+CD1a-) отличаются высокой экспрессией молекул, презентирующих антиген (HLA-DR) и обеспечивающих миграцию ДК в лимфатические узлы (CCR7), а также костимулирующих молекул CD80 и CD86, по сравнению с незрелыми ДК (CD83-CD1a+). Установлено, что индукция зрелыми ДК стимулирует рост относительного содержания пролиферирующих Т-клеток по сравнению со стимуляцией незрелыми ДК (р<0,001) и специфическим РТА+ опухолевым лизатом (р<0,001). При изучении цитотоксической активности эффекторных Т-лимфоцитов разработана 2D in vitro модель с использованием аналитической системы xCELLigence® и выявлено 2 типа взаимодействия: 1) лабораторная модель № 1 – снижение клеточного индекса (CI) культуры клеток аутологичной опухоли в присутствии активированных эффекторных Т-лимфоцитов; 2) лабораторная модель № 2 – отсутствие изменений CI культуры клеток аутологичной опухоли при ее кокультивировании с активированными эффекторными Т-клетками по сравнению с контролем (72 ч наблюдения). Результаты демонстрируют цитотоксическую активность антиген-специфических Т-лимфоцитов, что обусловлено высоким содержанием терминальнодифференцированных цитотоксических Т-лимфоцитов (TEMRA), ЦТЛ, продуцирующих GrB, и профилем секреции цитокинов.

Заключение. Разработаны требования к качеству персонализированной аутологичной ДКВ, включающие контроль иммунофенотипических характеристик, проведена оценка функциональной активности Т-лимфоцитов при индукции зрелыми вакцинными ДК. Разработан лабораторный регламент количественной оценки цитотоксической активности антиген-специфических Т-лимфоцитов в отношении аутологичной опухоли с использованием аналитической системы xCELLigence®, что позволит проводить персонализированный мониторинг и может прогнозировать эффективность проводимого лечения ДКВ.

1. Мельникова Е.В., Меркулова О.В., Чапленко А.А., Меркулов В.А. Дизайн доклинических исследований биомедицинских клеточных продуктов: особенности, ключевые принципы и требования. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2017; 17(3): 133–44.

2. Тихомирова А.В., Горячев Д.В., Меркулов В.А., Лысикова И.В., Губенко А.И., Зебрев А.И., Соловьева А.П., Ромодановский Д.П., Мельникова Д.В. Доклинические и клинические аспекты разработки биомедицинских клеточных продуктов. Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. 2018; 8(1): 23–35. doi: 10.30895/1991-29192018-8-1-23-35.

3. Seyhan A.A. Lost in translation: the valley of death across preclinical and clinical divide – identification of problems and overcoming obstacles. Transl Med Comm. 2019; 4(1). doi: 10.1186/s41231-019-0050-7.

4. Avdonkina N.A., Danilova A.B., Misyurin V.A., Prosekina E.A., Girdyuk D.V., Emelyanova N.V., Nekhaeva T.L., Gafton G.I., Baldueva I.A. Biological features of tissue and bone sarcomas investigated using an in vitro model of clonal selection. Pathology Res Pract. 2021 Jan; 217: 153214. doi: 10.1016/j.prp.2020.153214.

5. de Wolf C., van de Bovenkamp M., Hoefnagel M. Regulatory perspective on in vitro potency assays for human dendritic cells used in anti-tumor immunotherapy. Cytotherapy. 2018; 20(11): 1289–308. doi: 10.1016/j.jcyt.2018.07.006.

6. Buchholz M., Knauer J., Lehmann J., Hass M., Gargosky S. Qualification of the COSTIM assay to determine potency and use in clinical trials. Cytotherapy. 2013; 15(4). doi: 10.1016/j.jcyt.2013.01.197.

7. Lamano J.B., Ampie L., Choy W., Kesavabhotla K., DiDomenico J.D., Oyon D.E., Parsa A.T., Bloch O. Immunomonitoring in glioma immunotherapy: current status and future perspectives. J Neurooncol. 2016; 127(1): 1–13. doi: 10.1007/s11060-015-2018-4.

8. Park Y.S., Shin C., Hwang H.S., Zenke M., Han D.W., Kang Y.S., Ko K., Do Y., Ko K. In vitro generation of functional dendritic cells differentiated from CD34 negative cells isolated from human umbilical cord blood. Cell Biol Int. 2015; 39(9): 1080–6. doi: 10.1002/cbin.10490.

9. Нехаева Т.Л. Оптимизация аутологичных дендритно-клеточных вакцин для лечения больных злокачественными новообразованиями. Сибирский онкологический журнал. 2013; 3: 52–6.

10. Балдуева И.А., Данилова А.Б., Нехаева Т.Л., Авдонкина Н.А., Емельянова Н.В., Беляев А.М. Клеточный продукт для нагрузки и активации дендритных клеток человека. Патент РФ № 2714208. Опубл. 13.02.2020.

11. Freshney R.I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. John Wiley and Sons, 2015. 736 p.

12. Chiu C.H., Lei K.F., Yeh W.L., Chen P., Chan Y.S., Hsu K.Y., Chen A.C. Comparison between xCELLigence biosensor technology and conventional cell culture system for real-time monitoring human tenocytes proliferation and drugs cytotoxicity screening. J Orthop Surg Res. 2017; 12(1): 149. doi: 10.1186/s13018-017-0652-6.

13. Lewis D.M., Park K.M., Tang V., Xu Y., Pak K., Eisinger-Mathason T.S., Simon M.C., Gerecht S. Intratumoral oxygen gradients mediate sarcoma cell invasion. Proc Natl Acad Sci USA. 2016; 113(33): 9292–7. doi: 10.1073/pnas.1605317113.

14. Нехаева Т.Л., Емельянова Н.В., Осипчук А.В., Блохина М.Л., Семёнов А.Л., Скачкова О.В., Данилова А.Б., Новик А.В., Авдонкина Н.А., Просекина Е.А., Пипиа Н.П., Зозуля А.Ю., Водолажский Д.И., Балдуева И.А. Адаптация метода оценки Т-клеточной пролиферации при изучении специфического противоопухолевого иммунного ответа на дендритно-клеточную вакцину на основе раково-тестикулярных антигенов in vitro. Материалы VI Петербургского международного онкологического форума «Белые ночи 2020». СПб., Вопросы онкологии. С. 143.

15. Нехаева Т.Л., Карпов А.Е., Пипиа Н.П. Поиск иммунотерапевтических мишеней в онкологии при формировании иммунологического синапса. Вопросы онкологии. 2021; 67(3): 344–9. doi: 10.37469/0507-3758-2021-673-344-349.

16. Cunningham S., Hackstein H. Recent Advances in Good Manufacturing Practice-Grade Generation of Dendritic Cells. Transfus Med Hemother. 2020; 47(6): 454–63. doi: 10.1159/000512451.

17. Tai Y., Wang Q., Korner H., Zhang L., Wei W. Molecular Mechanisms of T Cells Activation by Dendritic Cells in Autoimmune Diseases. Front Pharmacol. 2018; 9: 642. doi: 10.3389/fphar.2018.00642.

18. Binnewies M., Mujal A.M., Pollack J.L., Combes A.J., Hardison E.A., Barry K.C., Tsui J., Ruhland M.K., Kersten K., Abushawish M.A., Spasic M., Giurintano J.P., Chan V., Daud A.I., Ha P., Ye C.J., Roberts E.W., Krummel M.F. Unleashing Type-2 Dendritic Cells to Drive Protective Antitumor CD4+ T Cell Immunity. Cell. 2019; 177(3): 556–71. doi: 10.1016/j.cell.2019.02.005.

19. Passeri L., Marta F., Bassi V., Gregori S. Tolerogenic Dendritic Cell-Based Approaches in Autoimmunity. Int J Mol Sci. 2021; 22(16): 8415. doi: 10.3390/ijms22168415.

20. Данилова А.Б., Нехаева Т.Л., Ефремова Н.А., Новик А.В., Зозуля А.Ю., Гафтон Г.И., Балдуева И.А. Оценка эффективности использования тумороидов для индивидуального подбора лекарственной терапии солидных опухолей. Вопросы онкологии. 2021; 67(6): 815–28. doi: 10.37469/0507-3758-2021-67-6-815-828.

21. Danilova A.B., Efremova N.A., Murashkina A.A., NekhaevaT.L., Maydin M.A., Artemyeva E.S., Artemyeva A.S., Baldueva I.A. Evolution of the Solid Human Tumor Cells Properties in Various Experimental Systems in Vitro. J Hematol Oncol Res. 2022; 4(2): 9–29. doi: 10.14302/issn.2372-6601.jhor-22-4061.

22. Pham P.V., Le H.T., Vu B.T., Pham V.Q., Le P.M., Phan N.L., Trinh N.V., Nguyen H.T., Nguyen S.T., Nguyen T.L., Phan N.K. Targeting breast cancer stem cells by dendritic cell vaccination in humanized mice with breast tumor: preliminary results. Onco Targets Ther. 2016; 9: 4441–51. doi: 10.2147/OTT.S105239.

23. Ya G., Ren W., Qin R., He J., Zhao S. Role of myeloid-derived suppressor cells in the formation of pre-metastatic niche. Front Oncol. 2022; 12. doi: 10.3389/fonc.2022.975261.

24. Riegel K., Yurugi H., Schlöder J., Jonuleit H., Kaulich M., Kirschner F., Arnold-Schild D., Tenzer S., Schild H., Rajalingam K. ERK5 modulates IL-6 secretion and contributes to tumor-induced immune suppression. Cell Death Dis. 2021; 12(11): 969. doi: 10.1038/s41419-021-04257-8.

25. Binnewies M., Roberts E.W., Kersten K., Chan V., Fearon D.F., Merad M., Coussens L.M., Gabrilovich D.I., Ostrand-Rosenberg S., Hedrick C.C., Vonderheide R.H., Pittet M.J., Jain R.K., Zou W., Howcroft T.K., Woodhouse E.C., Weinberg R.A., Krummel M.F. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nat Med. 2018; 24(5): 541–50. doi: 10.1038/s41591-018-0014-x.

26. Lippitz B.E., Harris R.A. Cytokine patterns in cancer patients: A review of the correlation between interleukin 6 and prognosis. Oncoimmunology. 2016; 5(5). doi: 10.1080/2162402X.2015.1093722.

27. Schupp J., Krebs F.K., Zimmer N., Trzeciak E., Schuppan D., Tuettenberg A. Targeting myeloid cells in the tumor sustaining microenvironment. Cell Immunol. 2019; 343. doi: 10.1016/j.cellimm.2017.10.013.

28. Stephen B., Hajjar J. Overview of Basic Immunology for Clinical Investigators. Adv Exp Med Biol. 2017; 995: 1–31. doi: 10.1007/978-3319-53156-4_1.

29. Belli C., Trapani D., Viale G., D’Amico P., Duso B.A., Della Vigna P., Orsi F., Curigliano G. Targeting the microenvironment in solid tumors. Cancer Treat Rev. 2018; 65: 22–32. doi: 10.1016/j.ctrv.2018.02.004.

30. Stakheyeva M., Patysheva M., Kaigorodova E., Zavyalova M., Tarabanovskaya N., Choynzonov E., Cherdyntseva N. Tumor Properties Mediate the Relationship between Peripheral Blood Monocytes and Tumor-Associated Macrophages in Breast Cancer. Cancer Invest. 2022; 40(5): 442–56. doi: 10.1080/07357907.2021.2016803.

31. Данилова А.Б., Новик А.В., Нехаева Т.Л., Балдуева И.А. Роль факторов иммуносупрессии в прогнозе эффективности клеточной иммунотерапии у пациентов с солидными опухолями. Эффективная фармакотерапия. 2022; 18(17): 8–17. doi: 10.33978/2307-3586-2022-18-17-8-17.

32. Fridman W.H., Zitvogel L., Sautès-Fridman C., Kroemer G. The immune contexture in cancer prognosis and treatment. Nat Rev Clin Oncol. 2017; 14(12): 717–34. doi: 10.1038/nrclinonc.2017.101.

33. Cassioli C., Baldari C.T. The Expanding Arsenal of Cytotoxic T Cells. Front Immunol. 2022; 13. doi: 10.3389/fimmu.2022.883010.

34. Voskoboinik I., Whisstock J.C., Trapani J.A. Perforin and granzymes: function, dysfunction and human pathology. Nat Rev Immunol. 2015; 15(6): 388–400. doi: 10.1038/nri3839.