УСЛОВИЯ ЭФФЕКТИВНОГО ПОДАВЛЕНИЯ ПЦР С ПОМОЩЬЮ LNA-ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ПРОСТОЙ И ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ ДЕТЕКЦИИ СОМАТИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ

Специфическое блокирование амплификации аллеля дикого типа в ПЦР с помощью олигонуклеотидов, модифицированных по остатку рибозы (закрытые нуклеиновые кислоты, locked nucleic acids, LNA), используется для высокочувствительной детекции соматических мутаций в опухолях. Описаны различные версии метода анализа мутаций с использованием LNA-олигонуклеотидов как с дополнительной модификацией фосфотиоатными группами, так и без таких групп, при этом использовались  различные ДНК полимеразы. В работе проведен анализ оптимальных условий для успешного специфического блокирования ПЦР с помощью LNA-олигонуклеотидов при анализе мутаций в генах KRAS и  BRAF. Мы обнаружили, что фосфотиоатная защита на 5’-конце олигонуклеотидов не влияет на эффективность блокирования аллеля дикого типа. Выявлено, что для большинства последовательностей  эффективное блокирование наблюдается при проведении шага отжига и элонгации ПЦР при температуре на  20–25°С ниже температуры плавления LNA-олигонуклеотида. При таких условиях реакции возможна простая и высокочувствительная детекция мутаций в генах KRAS и BRAF с использованием как секвенирования по Сэнгеру, так и ПЦР в реальном времени с Taqman зондами.

1. Dominguez P.L., Kolodney M.S. Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene. 2005 Oct 13; 24(45): 6830–4. doi: 10.1038/sj.onc.1208832.

2. Sidon P., Heimann P., Lambert F., Dessars B., Robin V., El Housni H. Combined locked nucleic acid and molecular beacon technologies for sensitive detection of the JAK2V617F somatic single-base sequence variant. Clin Chem. 2006; 52(7): 1436– 1438. doi: 10.1373/clinchem.2006.066886.

3. Thiede C., Creutzig E., Illmer T., Schaich M., Heise V., Ehninger G., Landt O. Rapid and sensitive typing of NPM1 mutations using LNAmediated PCR clamping. Leukemia. 2006; 20(10): 1897–1899. doi: 10.1038/sj.leu.2404367.

4. Arcila M., Lau C., Nafa K., Ladanyi M. Detection of KRAS and BRAF mutations in colorectal carcinoma roles for high-sensitivity locked nucleic acid-PCR sequencing and broad-spectrum mass spectrometry genotyping. J Mol Diagn. 2011 Jan; 13(1): 64–73. doi: 10.1016/j.jmoldx.2010.11.005.

5. Koshkin A.A., Singh S.K., Nielsen P., Rajwanshi V.K., Kumar R., Meldgaard M., Wengel J. LNA (Locked Nucleic Acids): Synthesis of the adenine, cytosine, guanine, 5- methylcytosine, thymine and uracil bicyclonucleoside monomers, oligomerisation, and unprecedented nucleic acid recognition. Tetrahedron. 1998; 54(14): 3607–3630.

6. You Y., Moreira B.G., Behlke M.A., Owczarzy R. Design of LNA probes that improve mismatch discrimination. Nucleic Acids Res. 2006; 34(8): e60. doi: 10.1093/nar/gkl175.

7. Owczarzy R., You Y., Groth C.L., Tataurov A.V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 2011; 50(43): 9352–9367. doi: 10.1021/bi200904e.

8. Yu D., Mukai M., Liu Q., Steinman C.R. Specific inhibition of PCR by non-extendable oligonucleotides using a 5’ to 3’ exonuclease-deficient DNA polymerase. Biotechniques. 1997; 23(4): 714–716, 718–720.

9. Laughlin T.S., Becker M.W., Liesveld J.L., Mulford D.A., Abboud C.N., Brown P., Rothberg P.G. Rapid method for detection of mutations in the nucleophosmin gene in acute myeloid leukemia. J Mol Diagn. 2008 Jul; 10(4): 338–45. doi: 10.2353/jmoldx.2008.070175.

10. Laughlin T.S., Moliterno A.R., Stein B.L., Rothberg P.G. Detection of exon 12 Mutations in the JAK2 gene: enhanced analytical sensitivity using clamped PCR and nucleotide sequencing. J Mol Diagn. 2010 May; 12(3): 278–82. doi: 10.2353/jmoldx.2010.090177.

11. Huang Q., Wang G.Y., Huang J.F., Zhang B., Fu W.L. High sensitive mutation analysis on KRAS gene using LNA/DNA chimeras as PCR amplification blockers of wild-type alleles. Mol Cell Probes. 2010; 24(6): 376–380. doi: 10.1016/j.mcp.2010.07.010.

12. Exiqon [Internet]. URL: https://www.exiqon.com/oligo-tools (cited 25 June 2018).

13. Nafa K., Hameed M., Arcila M.E. Locked Nucleic Acid Probes (LNA) for Enhanced Detection of Low-Level, Clinically Significant Mutations. Methods Mol Biol. 2016; 1392: 71–82. doi: 10.1007/978-1-4939-3360-0_8.

14. Pavlov A.R., Pavlova N.V., Kozyavkin S.A., Slesarev A.I. Cooperation between catalytic and DNA binding domains enhances thermostability and supports DNA synthesis at higher temperatures by thermostable DNA polymerases. Biochemistry. 2012 Mar 13; 51(10): 2032–43. doi: 10.1021/bi2014807.

15. OligoAnalyzer 3.1. [Internet]. URL: http://eu.idtdna.com/calc/analyzer. (cited 25 June 2018).

16. Stadler J., Eder J., Pratscher B., Brandt S., Schneller D., Müllegger R., Vogl C., Trautinger F., Brem G., Burgstaller J.P. SNPase-ARMS qPCR: Ultrasensitive Mutation- Based Detection of Cell-Free Tumor DNA in Melanoma Patients. PLoS One. 2015 Nov 12; 10(11): e0142273. doi: 10.1371/journal.pone.0142273.