Оптимизация метода исследования маммосферообразования для оценки il-6 индуцированной стволовой пластичности дифференцированных клеток рака молочной железы

Цель исследования – оптимизация метода оценки образования маммосфер после индуцированной интерлейкином 6 (IL6) стволовой пластичности у дифференцированных (CD44– ) опухолевых клеток линии рака молочной железы человека T47D.

Материал и методы. Проведена оценка жизнеспособности, цитофлуориметрического профиля клеток и их способности к маммосферообразованию при различной исходной конфлюентности (40–50 % и 70–80 %) и методах снятия с поверхности пластика (использование TrypLE, аккутазы, скребка для клеток). Жизнеспособность клеток оценивали методом проточной цитометрии с использованием флуоресцентно-меченного АннексинV и йодистого пропидия. Динамику изменения экспрессии поверхностных маркеров клеток оценивали методом проточной цитометрии с флуоресцентно-меченными антителами к CD24 и CD44.

Результаты. Применение скребка для снятия клеток приводило к существенному повышению количества клеток с цитофлуориметрическими признаками раннего и позднего апоптоза по сравнению с использованием TrypLE и аккутазы. Использование TrypLE приводило к снижению количества CD44⁺ клеток, тогда как аккутаза не влияла на представленность данного маркера. Количество маммосфер и их средний диаметр не отличались между исследуемыми группами. Стимуляция дифференцированных (CD44– CD24⁺) клеток линии T47D IL6 уже через 24 ч приводила к появлению популяций CD44⁺CD24⁺ прогениторных и CD44⁺CD24^–/low опухолевых стволовых клеток. Дифференцированные клетки после стимуляции IL6 в течение 24 ч образовывали в 3 раза больше маммосфер по сравнению с контролем.

Заключение. Для оценки маммосферообразования целесообразно использовать клетки с конфлюентностью до 80 % и применять аккутазу для снятия с поверхности пластика. Для стимуляции стволовой пластичности у дифференцированных клеток линии T47D достаточной является их инкубация с IL6 в течение 24 ч. 

1. Fumagalli A., Oost K.C., Kester L., Morgner J., Bornes L., Bruens L., Spaargaren L., Azkanaz M., Schelfhorst T., Beerling E., Heinz M.C., Postrach D., Seinstra D., Sieuwerts A.M., Martens J.W.M., van der Elst S., van Baalen M., Bhowmick D., Vrisekoop N., Ellenbroek S.I.J., Suijkerbuijk S.J.E., Snippert H.J., van Rheenen J. Plasticity of Lgr5-Negative Cancer Cells Drives Metastasis in Colorectal Cancer. Cell Stem Cell. 2020; 26(4): 569–78. doi: 10.1016/j.stem.2020.02.008.

2. Hanahan D. Hallmarks of Cancer: New Dimensions. Cancer Discov. 2022; 12(1): 31–46. doi: 10.1158/2159-8290.CD-21-1059.

3. Litviakov N., Ibragimova M., Tsyganov M., Kazantseva P., Deryusheva I., Pevzner A., Doroshenko A., Garbukov E., Tarabanovskaya N., Slonimskaya E. Amplifcations of stemness genes and the capacity of breast tumors for metastasis. Oncotarget. 2020; 11(21): 1988–2001. doi: 10.18632/oncotarget.27608.

4. Bhandary L., Bailey P.C., Chang K.T., Underwood K.F., Lee C.J., Whipple R.A., Jewell C.M., Ory E., Thompson K.N., Ju J.A., Mathias T.M., Pratt S.J.P., Vitolo M.I., Martin S.S. Lipid tethering of breast tumor cells reduces cell aggregation during mammosphere formation. Sci Rep. 2021; 11(1): 3214. doi: 10.1038/s41598-021-81919-9.

5. Bailey P.C., Lee R.M., Vitolo M.I., Pratt S.J.P., Ory E., Chakrabarti K., Lee C.J., Thompson K.N., Martin S.S. Single-Cell Tracking of Breast Cancer Cells Enables Prediction of Sphere Formation from Early Cell Divisions. iScience. 2018; 8: 29–39. doi: 10.1016/j.isci.2018.08.015.

6. Lombardo Y., de Giorgio A., Coombes C.R., Stebbing J., Castellano L. Mammosphere formation assay from human breast cancer tissues and cell lines. J Vis Exp. 2015; (97): 52671. doi: 10.3791/52671.

7. Montales M.T., Rahal O.M., Kang J., Rogers T.J., Prior R.L., Wu X., Simmen R.C. Repression of mammosphere formation of human breast cancer cells by soy isofavone genistein and blueberry polyphenolic acids suggests diet-mediated targeting of cancer stem-like/progenitor cells. Carcinogenesis. 2012; 33(3): 652–60. doi: 10.1093/carcin/bgr317.

8. Iriondo O., Rábano M., Domenici G., Carlevaris O., López-Ruiz J.A., Zabalza I., Berra E., Vivanco M. Distinct breast cancer stem/progenitor cell populations require either HIF1α or loss of PHD3 to expand under hypoxic conditions. Oncotarget. 2015; 6(31): 31721–39. doi: 10.18632/oncotarget.5564.

9. Kessel S.L., Chan L.L. A High-Throughput Image Cytometry Method for the Formation, Morphometric, and Viability Analysis of Drug-Treated Mammospheres. SLAS Discov. 2020; 25(7): 723–33. doi: 10.1177/2472555220922817.

10. Gallegos K.M., Patel J.R., Llopis S.D., Walker R.R., Davidson A.M., Zhang W., Zhang K., Tilghman S.L. Quantitative Proteomic Profling Identifes a Potential Novel Chaperone Marker in Resistant Breast Cancer. Front Oncol. 2021; 11: 540134. doi: 10.3389/fonc.2021.540134.

11. Wang D., Naydenov N.G., Dozmorov M.G., Koblinski J.E., Ivanov A.I. Anillin regulates breast cancer cell migration, growth, and metastasis by non-canonical mechanisms involving control of cell stemness and diferentiation. Breast Cancer Res. 2020; 22(1): 3. doi: 10.1186/s13058- 019-1241-x.

12. Ren J., Wang H., Tran K., Civini S., Jin P., Castiello L., Feng J., Kuznetsov S.A., Robey P.G., Sabatino M., Stroncek D.F. Human bone marrow stromal cell confuence: efects on cell characteristics and methods of assessment. Cytotherapy. 2015; 17(7): 897–911. doi: 10.1016/j.jcyt.2015.03.607.

13. Vlachou T., Aobuli X., D’Elia E., Santoro A., Moroni M.C., Pelicci P.G. Quantifcation of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures. J Vis Exp. 2019; (153). doi: 10.3791/60256.

14. Quan Y., Yan Y., Wang X., Fu Q., Wang W., Wu J., Yang G., Ren J., Wang Y. Impact of cell dissociation on identifcation of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 2012–2013; 12(3): 125–33. doi: 10.3233/CBM-130300.

15. Zöller M. CD44: can a cancer-initiating cell proft from an abundantly expressed molecule? Nat Rev Cancer. 2011; 11(4): 254–67. doi: 10.1038/nrc3023.

16. Abaurrea A., Araujo A.M., Caffarel M.M. The Role of the IL-6 Cytokine Family in Epithelial-Mesenchymal Plasticity in Cancer Progression. Int J Mol Sci. 2021; 22(15): 8334. doi: 10.3390/ijms22158334.

17. West N.R., Murray J.I., Watson P.H. Oncostatin-M promotes phenotypic changes associated with mesenchymal and stem cell-like diferentiation in breast cancer. Oncogene. 2014; 33(12): 1485–94. doi: 10.1038/onc.2013.105.

18. Junk D.J., Bryson B.L., Smigiel J.M., Parameswaran N., Bartel C.A., Jackson M.W. Oncostatin M promotes cancer cell plasticity through cooperative STAT3-SMAD3 signaling. Oncogene. 2017; 36(28): 4001–13. doi: 10.1038/onc.2017.33.

19. Xie G., Yao Q., Liu Y., Du S., Liu A., Guo Z., Sun A., Ruan J., Chen L., Ye C., Yuan Y. IL-6-induced epithelial-mesenchymal transition promotes the generation of breast cancer stem-like cells analogous to mammosphere cultures. Int J Oncol. 2012; 40(4): 1171–9. doi: 10.3892/ijo.2011.1275.