Характеристика стволовых признаков EpCAM-негативных и EpCAM-позитивных опухолевых клеток в первичной опухоли, 2D- и 3D-культурах при раке молочной железы

Одним из предикторов неблагоприятного прогноза при раке молочной железы (РМЖ) считается гиперэкспрессия белка EpCAM. Однако значительная доля опухолевых клеток либо слабо экспрессирует, либо вовсе не экспрессирует мембранный EpCAM. Молекулярная характеристика и способность к росту в 2D- и 3D-культурах, косвенно отражающие метастатический потенциал опухолевых клеток без экспрессии EpCAM, исследованы недостаточно.

Цель исследования – сравнение фенотипических вариантов стволовых клеток и проявлений эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) в зависимости от экспрессии EpCAM в первичной опухоли молочной железы и при культивировании в 2D и 3D.

Материал и методы. В исследование включено 7 пациенток с инвазивной карциномой молочной железы неспецифического типа (люминальный А и люминальный В HER2-негативный подтип). Пациентки не получали неоадъювантной химиотерапии. В первичной опухоли и после 2D- и 3D-культивирования проводилось фенотипирование клеток методом проточной цитофлуориметрии с использованием антител против CD45, EpCAM (CD326), CK7/8, CD44, CD24, N-cadherin (CD325), ALDH и CD133.

Результаты. Все фенотипические варианты коэкспрессии маркеров стволовости CD44, CD24, CD133 и ALDH присутствовали как в первичной опухоли, так и в 2D- и 3D-культурах. Стволовые клетки имели признаки как эпителиальных, так и гибридных фенотипов ЭМП. В первичных опухолях, 2D- и 3D-культурах наименьшую долю составляли стволовые клетки с фенотипом CD44+CD24- и клетки с коэкспрессией CD44+CD24- с другими маркерами стволовости, наибольшую – стволовые клетки с фенотипами ALDH+ и ALDH+CD133+. Отмечалась выраженная внутри- и межопухолевая фенотипическая гетерогенность клеток первичных опухолей, 2D- и 3D-культур.

Заключение. Результаты свидетельствуют о том, что опухолевые клетки люминального молекулярно-биологического подтипа РМЖ, не экспрессирующие EpCAM, способны, как и EpCAM-положительные, проявлять различные фенотипические варианты стволовости и ЭМП в первичной опухоли и при культивировании в 2D- и в 3D-культурах. В большинстве случаев в одной опухолевой клетке наблюдается коэкспрессия нескольких маркеров стволовости. Фенотипический состав первичных опухолей, 2D- и 3D-культур характеризуется выраженной внутри- и межперсональной гетерогенностью.

1. Gires O., Pan M., Schinke H., Canis M., Baeuerle P.A. Expression and function of epithelial cell adhesion molecule EpCAM: where are we after 40 years? Cancer Metastasis Rev. 2020; 39(3): 969–87. doi: 10.1007/s10555-020-09898-3.

2. Winter M.J., Cirulli V., Briaire-de Bruijn I.H., Litvinov S.V. Cadherins are regulated by Ep-CAM via phosphaditylinositol-3 kinase. Mol Cell Biochem. 2007; 302(1–2): 19–26. doi: 10.1007/s11010-007- 9420-y.

3. Huang H.P., Chen P.H., Yu C.Y., Chuang C.Y., Stone L., Hsiao W.C., Li C.L., Tsai S.C., Chen K.Y., Chen H.F., Ho H.N., Kuo H.C. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) complex proteins promote transcription factormediated pluripotency reprogramming. J Biol Chem. 2011; 286(38): 33520–32. doi: 10.1074/jbc.M111.256164.

4. Tran K.A., Pietrzak S.J., Zaidan N.Z., Siahpirani A.F., McCalla S.G., Zhou A.S., Iyer G., Roy S., Sridharan R. Defning reprogramming checkpoints from single-cell analyses of induced pluripotency. Cell Reports. 2019; 27(6): 1726–41. doi: 10.1016/j.celrep.2019.04.056.

5. Bouchalova P., Bouchal P. Current methods for studying metastatic potential of tumor cells. Cancer Cell Int. 2022; 22(1): 394. doi: 10.1186/s12935-022-02801-w.

6. Barbosa M.A.G., Xavier C.P.R., Pereira R.F., Petrikaitė V., Vasconcelos M.H. 3D Cell Culture Models as Recapitulators of the Tumor Microenvironment for the Screening of Anti-Cancer Drugs. Cancers. 2021; 14(1): 190. doi: 10.3390/cancers14010190.

7. Grosse-Wilde A., Fouquier d’Hérouël A., McIntosh E., Ertaylan G., Skupin A., Kuestner R.E., del Sol A., Walters K.A., Huang S. Stemness of the hybrid Epithelial/Mesenchymal State in Breast Cancer and Its Association with Poor Survival. PLoS One. 2015; 10(5). doi: 10.1371/journal.pone.0126522.

8. Marcato P., Dean C.A., Pan D., Araslanova R., Gillis M., Joshi M., Helyer L., Pan L., Leidal A., Gujar S., Giacomantonio C.A., Lee P.W.K. Aldehyde dehydrogenase activity of breast cancer stem cells is primarily due to isoform ALDH1A3 and its expression is predictive of metastasis. Stem Cells. 2011; 29(1): 32–45. doi: 10.1002/stem.563.

9. Keller P.J., Lin A.F., Arendt L.M., Klebba I., Jones A.D., Rudnick J.A., DiMeo T.A., Gilmore H., Jefferson D.M., Graham R.A., Naber S.P., Schnitt S., Kuperwasser C. Mapping the cellular and molecular heterogeneity of normal and malignant breast tissues and cultured cell lines. Breast Cancer Res. 2010; 12(5). doi: 10.1186/bcr2755.

10. Lehmann C., Jobs G., Thomas M., Burtscher H., Kubbies M. Established breast cancer stem cell markers do not correlate with in vivo tumorigenicity of tumor-initiating cells. Int J Oncol. 2012; 41(6): 1932–42. doi: 10.3892/ijo.2012.1654.

11. Перельмутер В.М., Григорьева Е.С., Завьялова М.В., Таширева Л.А., Алифанов В.В., Савельева О.Е., Вторушин С.В., Чойнзонов Е.Л., Чердынцева Н.В. Проявления апоптоза в субпопуляциях циркулирующих опухолевых клеток с фенотипами, ассоциированными со стволовостью и эпителиально-мезенхимальным переходом, при карциноме молочной железы. Успехи молекулярной онкологии. 2022; 9(4): 96–111. doi: 10.17650/2313-805X-2022-9-4-96-111.

12. Manuel I.J., Beloqui I., Garcia-Garcia F., Leis O., VazquezMartin A., Eguiara A., Cuf S., Pavon A., Menendez J.A., Dopazo J., Martin A.G. Mammosphere formation in breast carcinoma cell lines depends upon expression of E-cadherin. PLoS One. 2013; 8(10). doi: 10.1371/journal.pone.0077281.

13. Friedland J.C., Lakins J.N., Kazanietz M.G., Chernoff J., Boettiger D., Weaver V.M. α6β4 integrin activates Rac-dependent p21-activated kinase 1 to drive NF-κB-dependent resistance to apoptosis in 3D mammary acini. J Cell Sci. 2007; 120(20): 3700–12. doi:10.1242/jcs.03484.

14. Strietz J., Stepputtis S.S., Follo M., Bronsert P., Stickeler E., Maurer J. Human Primary Breast Cancer Stem Cells Are Characterized by Epithelial-Mesenchymal Plasticity. Int J Mol Sci. 2021; 22(4): 1808. doi: 10.3390/ijms22041808.

15. Tohyama S., Fujita J., Fujita C., Yamaguchi M., Kanaami S., Ohno R., Sakamoto K., Kodama M., Kurokawa J., Kanazawa H., Seki T., Kishino Y., Okada M., Nakajima K., Tanosaki S., Someya S., Hirano A., Kawaguchi S., Kobayashi E., Fukuda K. Efcient large-scale 2D culture system for human induced pluripotent stem cells and differentiated cardiomyocytes. Stem cell reports. 2017; 9(5): 1406–14. doi: 10.1016/j.stemcr.2017.08.025.

16. Sarrio D., Franklin C.K., Mackay A., Reis-Filho J.S., Isacke C.M. Epithelial and mesenchymal subpopulations within normal basal breast cell lines exhibit distinct stem cell/progenitor properties. Stem Cells. 2012; 30(2): 292–303. doi: 10.1002/stem.791.