Технологии высокопроизводительного анализа метилирования ДНК: от генома к панелям генов

Актуальность. Метилирование ДНК регулирует множество биологических процессов, опосредуя нормальное развитие организма. Нарушения в паттернах метилирования ассоциированы с многочисленными патологическими состояниями, в особенности с наследственными и онкологическими заболеваниями. Важность данных аномалий подчеркивается их активным использованием в качестве клинически значимых биомаркеров для стратификации пациентов, мониторинга течения болезни, ранней диагностики и прогноза ответа на терапию. Выявление специфических паттернов метилирования возможно с помощью таргетных высокопроизводительных методов, обеспечивающих фокус на ключевых регионах интереса.

Цель исследования – анализ и обобщение литературных данных, описывающих применение технологий высокопроизводительного анализа метилирования ДНК, в том числе технологий, основанных на целевых (таргетных) подходах.

Материал и методы. Проведен систематический анализ литературных данных по базам данных PubMed, Web of Science, Scopus, посвященных особенностям проведения высокопроизводительного анализа метилирования ДНК при онкологических и некоторых генетически обусловленных патологиях. Проанализировано 113 источников, охватывающих период с 2000 по июнь 2025 г., 32 из которых использованы для написания обзора.

Результаты. Обобщены сведения о существующих технологиях высокопроизводительного анализа метилома, методах конверсии ДНК, их преимуществах и ограничениях. Рассмотрены существующие методы таргетного обогащения, их сильные и слабые стороны, а также возможности применения в научной и диагностической практике.

Заключение. Определение статуса метилирования ДНК перестало быть инструментом фундаментальных исследований, став одной из важных областей трансляционной медицины, особенно в онкологии. Современные методы анализа метилома позволяют выявлять эпигенетические маркеры для диагностики и прогноза заболеваний, выбирать оптимальную терапию, проводить поиск молекулярных мишеней для таргетных препаратов. Целевое обогащение ДНК позволяет повысить точность и чувствительность, снижая при этом стоимость анализа, а применение некоторых подходов способствует приложению таргетного анализа к сложным образцам. В совокупности с гибкостью выбора регионов интереса такие качества обусловливают применение целевых подходов не только в научно-исследовательской, но и в практической деятельности.

1. Yong W.S., Hsu F.M., Chen P.Y. Profiling genome-wide DNA methylation. Epigenetics Chromatin. 2016; 9: 26. doi: 10.1186/s13072016-0075-3.

2. Csepregi A., Ebert M.P., Röcken C., Schneider-Stock R., Hoffmann J., Schulz H. U., Roessner A., Malfertheiner P. Promoter methylation of CDKN2A and lack of p16 expression characterize patients with hepatocellular carcinoma. BMC cancer. 2010; 10: 317. doi: 10.1186/14712407-10-317.

3. Geissler F., Nesic K., Kondrashova O., Dobrovic A., Swisher E.M., Scott C.L., Wakefield M. Jr. The role of aberrant DNA methylation in cancer initiation and clinical impacts. Ther Adv Med Oncol. 2024; 16: 17588359231220511. doi: 10.1177/17588359231220511.

4. Lukosiute-Urboniene A., Mazeike A., Kazokaite M., Silkuniene G., Silkunas M., Barauskas V., Barauskas G., Gulbinas A., Dauksa A., Dambrauskas Z. Epigenetic Regulation of APAF-1 Through DNA Methylation in Pancreatic Cancer. Anticancer Res. 2020; 40(7): 3765–79. doi: 10.21873/anticanres.14366.

5. Kurpiel B., Thomas M. S., Mubeen M., Ring K.L., Modesitt S.C., Moskaluk C.A., Mills A.M. MLH1/PMS2-deficient Endometrial Carcinomas in a Universally Screened Population: MLH1 Hypermethylation and Germline Mutation Status. Int J Gynecol Pathol. 2022; 41(1): 1–11. doi: 10.1097/PGP.0000000000000767.

6. Parris T.Z., Kovács A., Hajizadeh S., Nemes S., Semaan M., Levin M., Karlsson P., Helou K. Frequent MYC coamplification and DNA hypomethylation of multiple genes on 8q in 8p11-p12-amplified breast carcinomas. Oncogenesis. 2014; 3(3): e95. doi: 10.1038/oncsis.2014.8.

7. Pavicic W., Joensuu E.I., Nieminen T., Peltomäki P. LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer. J Mol Med (Berl). 2012; 90(7): 827–35. doi: 10.1007/s00109-011-0854-z.

8. Huin V., Deramecourt V., Caparros-Lefebvre D., Maurage C.A., Duyckaerts C., Kovari E., Pasquier F., Buée-Scherrer V., Labreuche J., Behal H., Buée L., Dhaenens C.M., Sablonnière B. The MAPT gene is differentially methylated in the progressive supranuclear palsy brain. Mov Disord. 2016; 31(12): 1883–90. doi: 10.1002/mds.26820.

9. Fedotova E.Y., Iakovenko E.V., Abramycheva N.Y., Illarioshkin S.N. SNCA Gene Methylation in Parkinson’s Disease and Multiple System Atrophy. Epigenomes. 2023; 7(1): 5. doi: 10.3390/epigenomes7010005.

10. Behl T., Kyada A., Roopashree R., Nathiya D., Arya R., Kumar M.R., Khalid M., Gulati M., Sachdeva M., Fareed M., Patra P.K., Agrawal A., Wal P., Gasmi A. Epigenetic biomarkers in Alzheimer’s disease: Diagnostic and prognostic relevance. Ageing Res Rev. 2024; 102: 102556. doi: 10.1016/j.arr.2024.102556.

11. Elhamamsy A.R. Role of DNA methylation in imprinting disorders: an updated review. J Assist Reprod Genet. 2017; 34(5): 549–62. doi: 10.1007/s10815-017-0895-5.

12. Li Q., Hermanson P.J., Springer N.M. Detection of DNA Methylation by Whole-Genome Bisulfite Sequencing. Methods Mol Biol. 2018; 1676: 185–96. doi: 10.1007/978-1-4939-7315-6_11.

13. Gao Y., Zhao H., An K., Liu Z., Hai L., Li R., Zhou Y., Zhao W., Jia Y., Wu N., Li L., Ying J., Wang J., Xu B., Wu Z., Tong Z., He J., Sun Y. Whole-genome bisulfite sequencing analysis of circulating tumour DNA for the detection and molecular classification of cancer. Clin Transl Med. 2022; 12(8): e1014. doi: 10.1002/ctm2.1014.

14. Nakabayashi K., Yamamura M., Haseagawa K., Hata K. Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS). Methods Mol Biol. 2023; 2577: 39–51. doi: 10.1007/978-1-0716-2724-2_3.

15. Liu Y., Cheng J., Siejka-Zielińska P., Weldon C., Roberts H., Lopopolo M., Magri A., D’Arienzo V., Harris J.M., McKeating J.A., Song C.X. Accurate targeted long-read DNA methylation and hydroxymethylation sequencing with TAPS. Genome Biol. 2020; 21(1): 54. doi: 10.1186/s13059-020-01969-6.

16. Vaisvila R., Ponnaluri V.K.C., Sun Z., Langhorst B.W., Saleh L., Guan S., Dai N., Campbell M.A., Sexton B.S., Marks K., Samaranayake M., Samuelson J.C., Church H.E., Tamanaha E., Corrêa I.R., Pradhan S. Jr., Dimalanta E.T., Evans T.C., Williams L. Jr., Davis T.B. Enzymatic methyl sequencing detects DNA methylation at single-base resolution from picograms of DNA. Genome Res. 2021; 31(7): 1280–89. doi: 10.1101/gr.266551.120.

17. Guo P., Zheng H., Li Y., Li Y., Xiao Y., Zheng J., Zhu X., Xu H., He Z., Zhang Q., Chen J., Qiu M., Jiang M., Liu P., Chen H. Hepatocellular carcinoma detection via targeted enzymatic methyl sequencing of plasma cell-free DNA. Clin Epigenetics. 2023; 15(1): 2. doi: 10.1186/s13148-022-01420-6.

18. Clark S.J., Smallwood S.A., Lee H.J., Krueger F., Reik W., Kelsey G. Genome-wide base-resolution mapping of DNA methylation in single cells using single-cell bisulfite sequencing (scBS-seq). Nat Protoc. 2017; 12(3): 534–47. doi: 10.1038/nprot.2016.187.

19. Liu H., Zeng Q., Zhou J., Bartlett A., Wang B.A., Berube P., Tian W., Kenworthy M., Altshul J., Nery J.R., Chen H., Castanon R.G., Zu S., Li Y.E., Lucero J., Osteen J.K., Pinto-Duarte A., Lee J., Rink J., Cho S., Emerson N., Nunn M., O’Connor C., Wu Z., Stoica I., Yao Z., Smith K.A., Tasic B., Luo C., Dixon J.R., Zeng H., Ren B., Behrens M.M., Ecker J.R. Single-cell DNA methylome and 3D multi-omic atlas of the adult mouse brain. Nature. 2023; 624(7991): 366–77. doi: 10.1038/s41586-023-06805-y.

20. Clark S.J., Argelaguet R., Kapourani C.A., Stubbs T.M., Lee H.J., Alda-Catalinas C., Krueger F., Sanguinetti G., Kelsey G., Marioni J.C., Stegle O., Reik W. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nat Commun. 2018; 9(1): 781. doi: 10.1038/s41467-018-03149-4.

21. Miura F., Shibata Y., Miura M., Sangatsuda Y., Hisano O., Araki H., Ito T. Highly efficient single-stranded DNA ligation technique improves low-input whole-genome bisulfite sequencing by post-bisulfite adaptor tagging. Nucleic Acids Res. 2019; 47(15): e85. doi: 10.1093/nar/gkz435.

22. Jain M., Koren S., Miga K.H., Quick J., Rand A.C., Sasani T.A., Tyson J.R., Beggs A.D., Dilthey A.T., Fiddes I.T., Malla S., Marriott H., Nieto T., O’Grady J., Olsen H.E., Pedersen B.S., Rhie A., Richardson H., Quinlan A.R., Snutch T.P., Tee L., Paten B., Phillippy A.M., Simpson J.T., Loman N.J., Loose M. Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads. Nat Biotechnol. 2018; 36(4): 338–45. doi: 10.1038/nbt.4060.

23. Singh R.R. Target Enrichment Approaches for Next-Generation Sequencing Applications in Oncology. Diagnostics (Basel). 2022; 12(7): 1539. doi: 10.3390/diagnostics12071539.

24. Horn S. Target enrichment via DNA hybridization capture. Methods Mol Biol. 2012; 840: 177–88. doi: 10.1007/978-1-61779-516-9_21.

25. Kozarewa I., Armisen J., Gardner A.F., Slatko B.E., Hendrickson C.L. Overview of Target Enrichment Strategies. Curr Protoc Mol Biol. 2015; 112: 7.21.1–7.21.23. doi: 10.1002/0471142727.mb0721s112.

26. Wen L., Li J., Guo H., Liu X., Zheng S., Zhang D., Zhu W., Qu J., Guo L., Du D., Jin X., Zhang Y., Gao Y., Shen J., Ge H., Tang F., Huang Y., Peng J. Genome-scale detection of hypermethylated CpG islands in circulating cell-free DNA of hepatocellular carcinoma patients. Cell Res. 2015; 25(11): 1250–64. doi: 10.1038/cr.2015.126.

27. Wang J., Xia Y., Li L., Gong D., Yao Y., Luo H., Lu H., Yi N., Wu H., Zhang X., Tao Q., Gao F. Double restriction-enzyme digestion improves the coverage and accuracy of genome-wide CpG methylation profiling by reduced representation bisulfite sequencing. BMC Genomics. 2013; 14:11. doi: 10.1186/1471-2164-14-11.

28. Tanas A.S., Borisova M.E., Kuznetsova E.B., Rudenko V.V., Karandasheva K.O., Nemtsova M.V., Izhevskaya V.L., Simonova O.A., Larin S.S., Zaletaev D.V., Strelnikov V.V. Rapid and affordable genome-wide bisulfite DNA sequencing by XmaI-reduced representation bisulfite sequencing. Epigenomics. 2017; 9(6): 833–47. doi: 10.2217/epi-2017-0031.

29. Slesarev A., Viswanathan L., Tang Y., Borgschulte T., Achtien K., Razafsky D., Onions D., Chang A., Cote C. CRISPR/CAS9 targeted CAPTURE of mammalian genomic regions for characterization by NGS. Sci Rep. 2019; 9(1): 3587. doi: 10.1038/s41598-019-39667-4.

30. Malekshoar M., Azimi S.A., Kaki A., Mousazadeh L., Motaei J., & Vatankhah M. CRISPR-Cas9 Targeted Enrichment and Next-Generation Sequencing for Mutation Detection. J Mol Diagn. 2023; 25(5): 249–62. doi: 10.1016/j.jmoldx.2023.01.010.

31. Gabrieli T., Sharim H., Fridman D., Arbib N., Michaeli Y., Ebenstein Y. Selective nanopore sequencing of human BRCA1 by Cas9-assisted targeting of chromosome segments (CATCH). Nucleic Acids Res. 2018; 46(14): e87. doi: 10.1093/nar/gky411.

32. Payne A., Holmes N., Clarke T., Munro R., Debebe B.J., Loose M. Readfish enables targeted nanopore sequencing of gigabase-sized genomes. Nat Biotechnol. 2021; 39(4): 442–50. doi: 10.1038/s41587-020-00746-x.