Изучение функциональной значимости конфликтного варианта гена RAD51D при раке молочной железы

Патогенные мутации в генах репарации ДНК (таких как BRCA1/2, RAD50, RAD51D, PTEN и др.) ответственны за развитие наследственного рака молочной железы и яичников. Большое количество вариантов, выявляемых с помощью технологии NGS, имеют неизвестное или конфликтное клиническое значение. Реклассификация данных вариантов играет решающую роль в рутинной лабораторной практике.
Целью исследования явилась реклассификация варианта конфликтного значения гена RAD51D (rs145309168), обнаруженного у молодой пациентки бурятского происхождения с раком молочной железы, с использованием нонсенс-опосредованного распада мРНК (NMD) с последующим секвенированием по Сэнгеру.
Материал и методы. Полноэкзомное секвенирование (WES) было выполнено на ДНК, выделенной из цельной крови 16 пациенток с раком молочной железы бурятского этноса, у которых отсутствовали мутации в генах BRCA1/2 (данные не представлены). Диагноз пациенток подтвержден морфологически (T1–3N0–2M0). У всех обследованных женщин был диагностирован инвазивный (протоковый) рак молочной железы неспецифического типа. Патогенные варианты, ассоциированные с заболеванием, не выявлены. Далее были проанализированы редкие варианты (MAF<0,005) для оценки их влияния на сплайсинг РНК с использованием биоинформатических инструментов, таких как SpliceAI, ESEFinder, RESCUE-ESE и EX-SKIP. Редкий миссенс-вариант в гене RAD51D (rs145309168) был идентифицирован у 39-летней пациентки бурятского этноса с раком молочной железы. Замороженные лейкоциты этой пациентки были разделены на две группы: экспериментальную и контрольную. Образцы культивировали в течение 5–6 дней и обрабатывали пуромицином (только экспериментальную группу) в течение 4–6 ч перед выделением РНК для предотвращения NMD с последующим секвенированием по Сэнгеру.
Результаты. In vitro эксперименты проводились на живых лейкоцитах пациентки с раком молочной железы, имеющей вариант c.932T>A гена RAD51D. Ампликоны кДНК были получены из РНК, выделенной из контрольных и экспериментальных лейкоцитов (обработанных пуромицином для предотвращения деградации, опосредованной NMD). Для точной оценки аберраций сплайсинга транскрипты экспериментальных лейкоцитов сравнивались с транскриптами контрольных культур лейкоцитов с помощью секвенирования по Сэнгеру. Последовательности транскриптов кДНК сравниваемых образцов в обоих случаях сохраняют изучаемый вариант, что указывает на то, что вариант не активирует NMD и, следовательно, не влияет на сплайсинг.
Заключение. В данном исследовании впервые представлен in vitro анализ варианта RAD51D (rs145309168), найденного у молодой пациентки бурятского этноса с раком молочной железы. Наши экспериментальные данные демонстрируют, что вариант c.932T>A не нарушает нормальный сплайсинг, что служит основанием для реклассификации данного «Конфликтного варианта» на «Вероятно доброкачественный», что согласуется с литературными данными и данными ранних классификаций.

1. Godet I., Gilkes D.M. BRCA1 and BRCA2 mutations and treatment strategies for breast cancer. Integr Cancer Sci Ther. 2017; 4(1): 10.15761/ICST.1000228. doi: 10.15761/ICST.1000228.

2. Choi M.C. Clinical signifcance of variants of unknown signifcances in BRCA genes. J Gynecol Oncol. 2019; 30(4): e80. doi: 10.3802/jgo.2019.30.e80.

3. Yi Z., Sanjeev M., Singh G. The Branched Nature of the NonsenseMediated mRNA Decay Pathway. Trends Genet. 2021; 37(2): 143–59. doi: 10.1016/j.tig.2020.08.010.

4. Gervas P., Molokov A., Schegoleva A., Kiselev A., Babyshkina N., Pisareva L., Tyukalov Y., Choynzonov E., Cherdyntseva N. New germline mutations in non-BRCA genes among breast cancer women of Mongoloid origin. Mol Biol Rep. 2020; 47(7): 5315–21. doi: 10.1007/s11033-020-05612-2.

5. Gervas P., Molokov A., Babyshkina N., Ivanova A., Kollantay O., Buldakov M., Molonova L., Zarubin A., Choynzonov E., Cherdyntseva N. Whole Exome Sequencing Revealed Rare Variants in BRCA2, RAD51D, FANGC, CYP24A1 Genes in Breast/Ovarian Cancer Patients from a Small Buryat Ethnic Group. Asian Pac J Cancer Prev. 2026; 27(2): 651–58. doi: 10.31557/APJCP.2026.27.2.651.

6. Chen S., Francioli L.C., Goodrich J.K., Collins R.L., Kanai M., Wang Q., Alföldi J., Watts N.A., Vittal C., Gauthier L.D., Poterba T., Wilson M.W., Tarasova Y., Phu W., Grant R., Yohannes M.T., Koenig Z., Farjoun Y., Banks E., Donnelly S., Gabriel S., Gupta N., Ferriera S., Tolonen C., Novod S., Bergelson L., Roazen D., Ruano-Rubio V., Covarrubias M., Llanwarne C., Petrillo N., Wade G., Jeandet T., Munshi R., Tibbetts K., Genome Aggregation Database (gnomAD) Consortium, O’Donnell-Luria A., Solomonson M., Seed C., Martin A.R., Talkowski M.E., Rehm H.L., Daly M.J., Tiao G., Neale B.M., MacArthur D.G., Karczewski K.J. A genomic mutational constraint map using variation in 76,156 human genomes. Nature. 2024; 625(7993): 92–100. doi: 10.1038/s41586-023-06045-0.

7. Sung P.L., Wen K.C., Chen Y.J., Chao T.C., Tsai Y.F., Tseng L.M., Qiu J.T., Chao K.C., Wu H.H., Chuang C.M., Wang P.H., Huang C.F. The frequency of cancer predisposition gene mutations in hereditary breast and ovarian cancer patients in Taiwan: From BRCA1/2 to multi-gene panels. PLoS One. 2017; 12(9): e0185615. doi: 10.1371/journal.pone.0185615.

8. Konstanta I., Fostira F., Apostolou P., Stratikos E., Kalfakakou D., Pampanos A., Kollia P., Papadimitriou C., Konstantopoulou I., Yannoukakos D. Contribution of RAD51D germline mutations in breast and ovarian cancer in Greece. J Hum Genet. 2018; 63(11): 1149–58. doi: 10.1038/s10038-018-0498-8.

9. Cremin C., Lee M.K., Hong Q., Hoeschen C., Mackenzie A., Dixon K., McCullum M., Nuk J., Kalloger S., Karasinska J., Scudamore C., Kim P.T.W., Donnellan F., Lam E.C.S., Lim H.J., Neben C.L., Stedden W., Zhou A.Y., Schaeffer D.F., Sun S., Renouf D.J., Schrader K.A. Burden of hereditary cancer susceptibility in unselected patients with pancreatic ductal adenocarcinoma referred for germline screening. Cancer Med. 2020; 9(11): 4004–13. doi: 10.1002/cam4.2973.

10. Guindalini R.S.C., Viana D.V., Kitajima J.P.F.W., Rocha V.M., López R.V.M., Zheng Y., Freitas É., Monteiro F.P.M., Valim A., Schlesinger D., Kok F., Olopade O.I., Folgueira M.A.A.K. Detection of germline variants in Brazilian breast cancer patients using multigene panel testing. Sci Rep. 2022; 12(1): 4190. doi: 10.1038/s41598-022-07383-1.

11. Maggi J., Feil S., Gloggnitzer J., Maggi K., Bachmann-Gagescu R., Gerth-Kahlert C., Koller S., Berger W. Nanopore Deep Sequencing as a Tool to Characterize and Quantify Aberrant Splicing Caused by Variants in Inherited Retinal Dystrophy Genes. Int J Mol Sci. 2024; 25(17): 9569. doi: 10.3390/ijms25179569.

12. Häuser F., Gökce S., Werner G., Danckwardt S., Sollfrank S., Neukirch C., Beyer V., Hennermann J.B., Lackner K.J., Mengel E., Rossmann H. A non-invasive diagnostic assay for rapid detection and characterization of aberrant mRNA-splicing by nonsense mediated decay inhibition. Mol Genet Metab. 2020; 130(1): 27–35. doi: 10.1016/j.ymgme.2020.03.002.

13. Yao H., Li N., Yuan H. Clinical characteristics and survival analysis of Chinese ovarian cancer patients with RAD51D germline mutations. BMC Cancer. 2022; 22(1): 1337. doi: 10.1186/s12885-022-10456-z.

14. Jiang Y.J., Zhong J.H., Zhou Z.H., Qiu M.Q., Zhou X.G., Liu Y.C., Huo R.R., Liang X.M., Chen Z., Lin Q.L., Yu X.Y., Yu H.P. Association between polymorphisms in MicroRNA target sites of RAD51D genes and risk of hepatocellular carcinoma. Cancer Med. 2019; 8(5): 2545–52. doi: 10.1002/cam4.2068.

15. Greenhough L.A., Liang C.C., Belan O., Kunzelmann S., Maslen S., Rodrigo-Brenni M.C., Anand R., Skehel M., Boulton S.J., West S.C. Structure and function of the RAD51B-RAD51C-RAD51D-XRCC2 tumour suppressor. Nature. 2023; 619(7970): 650–57. doi: 10.1038/s41586-023-06179-1.

16. Jeon J.E., Chen K.T., Madison R., Schrock A.B., Sokol E., Levy M.A., Rozenblit M., Huang R.S.P., Pusztai L. Genomic landscape and homologous recombination repair defciency signature in stage I-III and de novo stage IV primary breast cancers. Oncologist. 2025; 30(5): oyaf089. doi: 10.1093/oncolo/oyaf089.